Фиксация этанола и daPI окрашивание: метод визуализации ДНК в C. elegans

Overview

Здесь мы описываем метод, используемый для визуализации геномной ДНК в фиксированных, нетронутых нематод. Видео включает в себя пример протокола для подсчета хроматина в неутилизованных C. elegans oocytes.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из Кларк и др., Манипуляция Ploidy в Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018).

Тетраплоидные штаммы могут быть проверены путем подсчета количества хромосом в их неопыляемых ооцитах. Флуоресцентная микроскопия может быть использована для проверки на количество хромосомных пар в неоплодных диплоидных яйцеклетках (до мейотических деления), если штамм имеет флуоресцентный маркер для хромосом. При отсутствии флуоресцентных хромосомных маркеров тетраплоидные нематоды могут быть проверены путем фиксации нематод и окрашивания красителем ДНК; см. ниже для протокола для фиксации этанола и цельного животного 4 ",6-Diamidine-2"-фенилиндол дигидрохлорид (DAPI) окрашивания.

Окрашивание всего животного DAPI

ПРИМЕЧАНИЕ: Тетраплоидные штаммы, несущие 12 соединенных хромосомных пар, могут быть подтверждены DAPI, окрашивая этих животных и подсчитывая количество тел DAPI в его неопутилизованных яйцеклетках.

1. Поместите от 5 до 10 мкл буфера M9 на слайд микроскопа, а затем перенесите 6 - 10 нематод на падение.
2. Под рассечением микроскопа, сделать большую часть M9 от капли, не удаляя нематод с ворса свободной очистки ткани. Затем, немедленно добавить 10 йл капли 90% этанола на червей. Разрешить червей высохнуть полностью, но не более чем на пару секунд.
3. Как только этанол испаряется (это видно, как это происходит под рассечением микроскопа), добавить дополнительные 10 йл 90% этанола на червей.
4. Повторите шаг 3.1.3 еще три раза.
5. После того, как последняя капля этанола испарится, добавьте 6 л красителя DAPI или Hoechst при рекомендуемой конечной концентрации в монтажных средствах массовой информации выбора (например, 1:1000 разбавления 2 нг/Л концентрации запасов ДАПИ в M9). Для длительного хранения слайдов, 0,5% р-фенилендиамин растворяется в 20 мМ Трис-HCl, рН 8,8, в 90% глицерол в качестве антифада решение, а не только M9, могут быть использованы.
6. Обложка червей на слайде с крышкой и печать края крышки с лаком для ногтей. Оценка в флуоресценции микроскопа (шаг 3.1.7) по крайней мере 10 минут после добавления крышки. Слайды без антифады можно хранить в течение нескольких дней при 4 градусов по Цельсию, но качество флуоресценции начинает снижаться через несколько дней.
7. Используя флуоресцентный микроскоп при увеличении 100X, оценка числа отдельных тел DAPI (предположительно одной хромосомы пар) в наиболее зрелых неоплодотвореных яйцеклеток, который непосредственно примыкает к сперматеке и еще не вошел в сперматека или матки.
   1. Для оценки отдельных органов DAPI в ядре яйцеклетки, используйте тонкий фокус микроскопа, чтобы медленно двигаться от верхней части ядра яйцеклетки на дно во время подсчета голосов. Затем пересчитать то же ядро при перемещении фокуса в противоположном направлении(т.е.снизу вверху ядра), чтобы подтвердить подсчитанное количество тел DAPI.
8. Оценка наиболее зрелых нефертилизованных яйцеклеток в каждом из двух гонад, по крайней мере десять гермафродитов на стабильный штамм Лон. Дикие ооциты типа имеют 6 daPI органов в среднем, 5 автоматических пар, и пара половой хромосомы. Наличие 12 тел DAPI в яйцеклетке стабильных штаммов Lon указывает на то, что животные в этом штамме являются либо частичными (4 набора аутосом, 3 Х-хромосомы), либо полными (4 набора аутосом, 4 Х-хромосомы) тетраплоидами.
9. Рассчитайте среднее количество тел DAPI, наблюдаемое из нескольких (не менее 10) яйцеклеток на штамм. Некоторые хромосомные пары будут касаться или прямо друг на друга, поэтому количество тел DAPI в яйцеклетке часто меньше, чем фактическое количество хромосомных пар.
10. (По желанию) Дальнейшая проверка стабильных штаммов Lon, где среднее количество тел DAPI составляет 12, чтобы проверить, являются ли они полными (4A, 4X) или частичные (4A, 3X) тетраплоиды иммунофторесценции окрашивания против хромосомных белков оси, таких как HTP-3. Это окрашивание будет различать хромосомные пары, показывая крестообразный узор от одиночных неподключенных хромосом, присутствующих в частичной тетраплоиде.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting Microscope	Motic Microscopy	SMZ171
Name	Company	Catalog Number	Comments
Staining
Hoechst 33258, Pentahydrate	Biotium	40045
DAPI	Biotium	40011
Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol Fixation
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP	Koptec, VWR	89125-166
Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Buffer
Sodium chloride, Biotechnology Grade	VWR	97061-278
Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade	VWR	97062-346
Sodium phosphate, monobasic dihydrate	Fisher Scientific	AC271750025