Fixação de etanol e Coloração DAPI: Um método para visualizar DNA em C. elegans

Overview

Aqui, descrevemos uma técnica usada para visualizar DNA genômico em nematoides fixos e intactos. O vídeo inclui um protocolo de exemplo para contar cromatina em oócitos C. elegans não fertilizados.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Clarke et al, Manipulação de Ploidy em Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018).

As cepas tetraploides podem ser validadas contando o número de cromossomos em seus oócitos não fertilizados. A microscopia fluorescente pode ser usada para testar o número de pares de cromossomos em oócitos diploides não fertilizados (antes das divisões meioticas), se a cepa tiver um marcador fluorescente para cromossomos. Na ausência de marcadores de cromossomo fluorescente, os nematoides tetraploides podem ser rastreados fixando os nematoides e manchando com um corante de DNA; veja abaixo um protocolo para fixação de etanol e coloração de 4′,6-Diamidina-2′-fenildlorida (DAPI).

Coloração de DAPI animal inteiro

NOTA: Cepas tetraploides que carregam 12 pares de cromossomos conectados podem ser validadas pela dapi manchando esses animais e contando o número de corpos DAPI em seus oócitos não fertilizados.

1. Coloque de 5 a 10 μL de tampão M9 em um slide de microscópio e, em seguida, transfira 6 - 10 nematoides para a queda.
2. Sob um microscópio dissecando, retire a maior parte do M9 da gota sem remover os nematoides com um tecido de limpeza sem fiapos. Em seguida, adicione imediatamente uma queda de 10 μL de 90% de etanol nos vermes. Deixe os vermes secarem completamente, mas por não mais do que alguns segundos.
3. Assim que o etanol evaporar (isso pode ser visto como acontece sob o microscópio de dissecação), adicione um adicional de 10 μL de 90% de etanol sobre os vermes.
4. Repita o passo 3.1.3 mais três vezes.
5. Uma vez que a última gota de etanol tenha evaporado, adicione 6 μL de corante DAPI ou Hoechst na concentração final recomendada na mídia de montagem de escolha (por exemplo, uma diluição de 1:1.000 de uma concentração de estoque DAPI de 2 ng/μL em M9). Para o armazenamento a longo prazo dos slides, 0,5% p-fenilediamina dissolvida em 20 mM Tris-HCl, pH 8.8, em 90% glicerol como solução antifato, em vez de apenas M9, pode ser usado.
6. Cubra os vermes no slide com uma mancha de cobertura e sele as bordas da tampa com esmalte. Pontuação em um microscópio de fluorescência (passo 3.1.7) pelo menos 10 minutos após a adição do deslizamento de tampas. Slides sem antifado podem ser armazenados por alguns dias a 4 °C antes de marcar, mas a qualidade da fluorescência começa a diminuir após alguns dias.
7. Usando um microscópio fluorescente na ampliação de 100X, escorra o número de corpos daPI únicos (presumivelmente pares de cromossomo único) no oócito não fertilizado mais maduro, que é imediatamente adjacente à espermatozoide e ainda não entrou na espermatozoide ou no útero.
   1. Para marcar corpos daPI individuais dentro de um núcleo oócito, use o foco fino do microscópio para mover-se lentamente do topo do núcleo oócito para o fundo durante a contagem. Em seguida, reconta o mesmo núcleo enquanto move o foco na direção oposta (ou seja,da parte inferior até a parte superior do núcleo) para confirmar o número contado de corpos DAPI.
8. Marque o oócito não fertilizado mais maduro em cada uma das duas gônadas em pelo menos dez hermafroditas por cepa lon estável. Os oócitos do tipo selvagem têm 6 corpos DAPI em média, 5 pares de autossómos e o par de cromossomos sexuais. A presença de 12 corpos DAPI no oócito de cepas estáveis de Lon indica que os animais nesta cepa são parciais (4 conjuntos de Autosomes, 3 cromossomos X) ou completos (4 conjuntos de autossomos, 4 cromossomos X).
9. Calcule o número médio de corpos DAPI observados a partir de vários (pelo menos 10) oócitos por cepa. Alguns pares de cromossomos estarão se tocando ou bem em cima um do outro, de modo que o número de corpos DAPI em um oócito é muitas vezes menor do que o número real de pares de cromossomos.
10. (Opcional) Valide ainda mais as cepas estáveis de Lon onde o número médio de corpos DAPI é de 12 para testar se eles estão cheios (4A, 4X) ou tetraploides parciais (4A, 3X) por manchas de imunofluorescência contra proteínas do eixo cromossomo, como HTP-3. Esta coloração distinguirá os pares de cromossomos mostrando um padrão cruciforme de cromossomos não ligados únicos presentes no tetraploide parcial.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting Microscope	Motic Microscopy	SMZ171
Name	Company	Catalog Number	Comments
Staining
Hoechst 33258, Pentahydrate	Biotium	40045
DAPI	Biotium	40011
Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol Fixation
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP	Koptec, VWR	89125-166
Name	Company	Catalog Number	Comments
M9 Buffer
Sodium chloride, Biotechnology Grade	VWR	97061-278
Potassium phosphate, Monobasic Anhydrous Grade	VWR	97062-346
Sodium phosphate, monobasic dihydrate	Fisher Scientific	AC271750025