Levetid Analyse: Måling C. elegans levetid

Overview

Denne video beskriver en traditionel, pladebaseret metode til måling af levetiden for C. elegans. Eksempelprotokollen måler levetiden for orme, der er behandlet med RNAi.

Protocol

Følgende protokol er et uddrag fra Cornwell et al, The Replica Set Metode: En high-throughput tilgang til kvantitativt Foranstaltning Caenorhabditis elegans Levetid, J. Vis. Exp.  (2018).

1. Forebyggelse af afkomproduktion ved tilsætning af 5-Fluoro-2'-deoxyuridin (FUdR)

1. Dyr dyrkes indtil L4-trin ved 20 °C. Kontroller, om synkroniserede dyr har udviklet sig til L4 ca. 40 timer efter såning (trin 2.1.7).
   BEMÆRK: C. elegans udviklingstid vil variere ved forskellige temperaturer, og vækstrater for mutante dyr, for hvilke der ikke er karakteriseret satser, skal testes empirisk.
   1. Der tilsættes 160 μL 50x FUdR til hver 6 cm plade med L4 dyr.
      BEMÆRK: Det er afgørende at tilføje FUdR på L4-scenen. For nemheds skyld, gøre 1.000x lagre af FUdR ved at opløse 1 g FUdR i 10 mL ultrapure H₂O. Filter-sterilisere lager FUdR med en 0,2 μm filter og en 10 cc sprøjte. Aliquot ~ 1 mL lager i sterile 1,5 mL rør. Frys og opbevar ved -20 °C.
2. Undersøg plader for tilstedeværelsen af mandlige C. elegans. Fjern alle hanner.
   BEMÆRK: Levetid måles typisk for hermafroditter og ikke mænd. Hermafroditter, der parrer sig, lever kortere end umatiske dyr, selv i nærværelse af FUdR. Mænd er mindre og tyndere end hermafrodit og kan let identificeres ved en karakteristisk hooked hale.
3. Sæt kassen tilbage i lynlåsposen. Tilbage til 20 °C inkubator.

2. Scoring levedygtighed

1. Score levedygtighed dagligt ved forsigtigt at røre dyret på hovedet med en platintråd eller øjenvipper. Score dyr, der undlader at bevæge sig som døde og fjerne dem fra pladen (Figur 1A). Registrer det antal, der er observeret dødt for hver betingelse for hvert observationstidspunkt.
   BEMÆRK: For at mindske risikoen for scoring bias, skal eksperimentatoren forblive blind for eksperimentelle forhold og må heller ikke henvise til resultaterne fra tidligere tidspoint under scoring.
2. Censurere dyr, der brister, dør af andre åbenlyse udviklingsfejl eller kryber op på siden af skålen: fjern disse dyr og registrer antallet på hvert observeret tidspunkt til overvejelse i den statistiske analyse. Derudover, hvis der findes mænd, skal du fjerne dem og registrere det observerede antal.
3. Gentag fra trin 2.1 dagligt, indtil ingen dyr forbliver i live.
   BEMÆRK: Hvis plænen af E. coli mindskes betydeligt, eller svampen begynder at vokse på pladen, overføres alle resterende dyr til en frisk plade med den relevante RNAi og FUdR.

Representative Results

Figur 1: Den traditionelle og replikasætmetoden til scoring af C.elegans levetid (A). Den traditionelle metode til at score C. elegans levetid. Flere små synkroniserede populationer af isogene dyr pr. Tilstand følges over tid. Den samme population af dyr følges under hele forsøgsforløbet. Levedygtighed vurderes ved bevægelse, som kan stimuleres ved blid prodding. Dyr, der undlader at bevæge sig, scores som døde og fjernes (aspiration vist), indtil der ikke er levedygtige dyr tilbage. (B). Replikasætmetoden til scoring af C. elegans levetid. En stor population af alderssynkrone isogene dyr fordeles på en række identiske replikatplader. På hvert tidspunkt scores en enkelt replikat: der tilsættes en mild bufferopløsning (M9), som stimulerer bevægelse. Dyr, der undlader at bevæge sig spontant efter oversvømmelser brønde vurderes også via touch stimulus. Eksperimentets scoringsvarighed bestemmes inden starten. Hvert dyr scores kun én gang, og levetiden for den større befolkning er afledt af mange uafhængige observationer. (C). Replikasætmetoden er en metode med høj overførselshastighed til kvantitativ måling af C. elegans levetid. 100 eller flere uafhængige RNAi-kloner kan spores samtidigt. HT115 E. coli, der udtrykker dsRNA for en given RNAi-klon, vises. Praktisk set er hver 24 prøver fra 96-brøndspladen opdelt i en enkelt 24-brønds plade. Hver resulterende 24-brønds plade har en negativ(dvs. tom vektor, rød brønd) og positiv kontrol (grøn brønd) tilfældigt fordelt i en samling af RNAi kloner (gule brønde). Typisk indeholder den første brønd (A1) i en samling en tom vektor. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine)	Alfa Aesar	L16497
24 Well Culture Plates	Greiner Bio-One	#662102
600 µL 96-well plates	Greiner Bio-One	#786261
2mL 96-well plates	Greiner Bio-One	#780286
96-pin plate replicator	Nunc	250520
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer	Source Bioscience	C. elegans RNAi Collection (Ahringer)	See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal	Source Bioscience	C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)	See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
L4440 Empty Vector Plasmid	Addgene	1654	https://www.addgene.org/1654/