Lebensdaueranalyse: Messung der Langlebigkeit von C. elegans

Overview

Dieses Video beschreibt eine traditionelle, plattenbasierte Methode zur Messung der Lebensdauer von C. elegans. Das Beispielprotokoll misst die Lebensdauer von Würmern, die mit RNAi behandelt werden.

Protocol

Das folgende Protokoll ist ein Auszug aus Cornwell et al, The Replica Set Method: A High-Throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan, J. Vis. Exp.  (2018).

1. Verhinderung der Nachkommenproduktion durch Zugabe von 5-Fluor-2'-Deoxyuridin (FUdR)

1. Tiere bis L4-Stufe bei 20 °C anbauen. Prüfen Sie, ob sich synchronisierte Tiere nach der Aussaat zu L4 entwickelt haben (Schritt 2.1.7).
   ANMERKUNG: Die Entwicklungszeit von C. elegans variiert bei unterschiedlichen Temperaturen, und die Wachstumsraten von mutierten Tieren, für die die Raten nicht charakterisiert wurden, müssen empirisch getestet werden.
   1. Fügen Sie 160 l 50x FUdR zu jeder 6 cm Platte mit L4-Tieren hinzu.
      HINWEIS: Es ist wichtig, FUdR in der L4-Stufe hinzuzufügen. Machen Sie 1.000x FUdR-Bestände, indem Sie 1 g FUdR in 10 ml Ultrareine H₂O auflösen. Filtersterilisieren Sie den Lager-FUdR mit einem 0,2-mm-Filter und einer 10-ccm-Spritze. Aliquot 1 ml Lager in sterile 1,5 ml Rohre. Einfrieren und lagern bei -20 °C.
2. Überprüfen Sie Die Platten auf das Vorhandensein von männlichen C. elegans. Entfernen Sie alle Männchen.
   HINWEIS: Die Lebensdauer wird in der Regel für Hermaphrodite und nicht für Männchen gemessen. Hermaphrodite, die sich paaren, leben kürzer als unverwandte Tiere, selbst in Gegenwart von FUdR. Männchen sind kleiner und dünner als Hermaphrodite und können leicht durch einen markanten Hakenschwanz identifiziert werden.
3. Legen Sie die Box wieder in die Reißverschlusstasche. Zurück zum 20 °C-Inkubator.

2. Scoring-Lebensfähigkeit

1. Erzielen Sie die Lebensfähigkeit täglich, indem Sie das Tier mit einem Platindraht oder einer Wimpernstimme sanft auf den Kopf berühren. Bewerten Sie Tiere, die sich nicht als tot bewegen, und entfernen Sie sie von der Platte (Abbildung 1A). Zeichnen Sie die Anzahl der toten Personen für jede Bedingung für jeden Beobachtungszeitpunkt auf.
   HINWEIS: Um das Risiko einer Punkteverzerrung zu verringern, muss der Experimentator blind gegenüber experimentellen Bedingungen bleiben und darf in ähnlicher Weise nicht auf die Ergebnisse früherer Zeitpunkte während der Bewertung verweisen.
2. Zensieren Sie Tiere, die brechen, an anderen offensichtlichen Entwicklungsfehlern sterben oder auf der Seite der Schale kriechen: Entfernen Sie diese Tiere und erfassen Sie die Zahl zu jedem beobachteten Zeitpunkt, um in der statistischen Analyse berücksichtigt zu werden. Zusätzlich, Wenn Männer gefunden werden, entfernen Sie sie und notieren Sie die Zahl beobachtet.
3. Wiederholen Sie dies täglich ab Schritt 2.1, bis keine Tiere am Leben bleiben.
   HINWEIS: Sollte der Rasen von E. coli deutlich abnehmen oder der Pilz auf dem Teller zu wachsen beginnt, übertragen Sie alle verbleibenden Tiere auf eine frische Platte mit dem entsprechenden RNAi und FUdR.

Representative Results

Abbildung 1: Die traditionelle und die Replikatsatzmethode zum Scoring der C.elegans-Lebensdauer (A). Die traditionelle Methode zum Scoring der Lebensdauer von C. elegans. Mehrere kleine synchronisierte Populationen von isogenen Tieren pro Zustand werden im Laufe der Zeit verfolgt. Die gleiche Population von Tieren wird während des gesamten Studiengangs verfolgt. Die Lebensfähigkeit wird durch Bewegung beurteilt, die durch sanftes Prodding stimuliert werden kann. Tiere, die sich nicht bewegen, werden als tot bewertet und entfernt (Aspiration gezeigt), bis keine lebensfähigen Tiere mehr übrig sind. (B). Die Replik-Set-Methode zum Scoring der Lebensdauer von C. elegans. Eine große Population alterssynchronisierter isogener Tiere verteilt sich auf eine Reihe identischer Replikationsplatten. Zu jedem Zeitpunkt wird eine einzige Replikation erzielt: eine leicht gepufferte Lösung (M9) wird hinzugefügt, die die Bewegung stimuliert. Tiere, die sich nach dem Hochwasser von Brunnen nicht spontan bewegen, werden ebenfalls mittels Berührungsreiz beurteilt. Die Bewertungsdauer für das Experiment wird vor dem Start bestimmt. Jedes Tier wird nur einmal bewertet und die Langlebigkeit für die größere Population wird aus vielen unabhängigen Beobachtungen abgeleitet. (C). Der Replica Set-Ansatz ist eine Methode mit hohem Durchsatz zur quantitativen Messung der Lebensdauer von C. elegans. 100 oder mehr unabhängige RNAi-Klone können gleichzeitig nachverfolgt werden. HT115 E. coli, der dsRNA für einen bestimmten RNAi-Klon exzessiumdrückt, wird gezeigt. Praktisch sind alle 24 Proben aus der 96-Well-Platte in eine einzige 24-Well-Platte unterteilt. Jede resultierende 24-Well-Platte hat einen negativen(d.h. leeren Vektor, roten Brunnen) und eine positive Kontrolle (grüner Brunnen), die zufällig innerhalb einer Sammlung von RNAi-Klonen (gelbe Brunnen) verteilt sind. In der Regel enthält der erste Brunnen (A1) in einer Auflistung einen leeren Vektor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine)	Alfa Aesar	L16497
24 Well Culture Plates	Greiner Bio-One	#662102
600 µL 96-well plates	Greiner Bio-One	#786261
2mL 96-well plates	Greiner Bio-One	#780286
96-pin plate replicator	Nunc	250520
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer	Source Bioscience	C. elegans RNAi Collection (Ahringer)	See also Kamath et. al, Nature 2003.
C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal	Source Bioscience	C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)	See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon.
L4440 Empty Vector Plasmid	Addgene	1654	https://www.addgene.org/1654/