Overview
סרטון זה מתאר שיטה מסורתית המבוססת על צלחת למדידת תוחלת החיים של C. elegans. פרוטוקול הדוגמה מודד את תוחלת החיים של תולעים שטופלו ב- RNAi.
Protocol
הפרוטוקול הבא הוא קטע מתוך קורנוול ואח ', שיטת קבוצת העותקים המשוכפלים: גישה בעלת תפוקה גבוהה למדידה כמותית של אגנס קנורהאבדיטיס תוחלת חיים, J. Vis. Exp. (2018).
1. מניעת ייצור צאצאים על ידי תוספת של 5-פלואורו-2'-deoxyuridine (FUdR)
- לגדל בעלי חיים עד שלב L4 ב 20 °C (69 °F). בדוק אם בעלי חיים מסונכרנים התפתחו ל- L4 כ- 40 שעות לאחר הזריעה (שלב 2.1.7).
הערה: זמן התפתחותי C. elegans ישתנה בטמפרטורות שונות ושיעורי הצמיחה של בעלי חיים מוטנטים שעבורם שיעורים לא התאפיינו חייבים להיבדק באופן אמפירי.- הוסף 160 μL של 50x FUdR לכל צלחת 6 ס"מ עם בעלי חיים L4.
שים לב: זה קריטי כדי להוסיף FUdR בשלב L4. לנוחות, להפוך 1,000x מניות של FUdR על ידי המסת 1 גרם FUdR לתוך 10 מ"ל אולטרה סגול H2O. מסנן-לעקר את המניות FUdR עם מסנן 0.2 מיקרומטר ומזרק 10 סמ"ק. Aliquot ~ 1 מ"ל של מלאי לתוך צינורות סטריליים 1.5 מ"ל. להקפיא ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
- הוסף 160 μL של 50x FUdR לכל צלחת 6 ס"מ עם בעלי חיים L4.
- בדוק לוחיות רישוי לנוכחותם של זכרים C. elegans. הסר את כל הזכרים.
שים לב: תוחלת החיים נמדדת בדרך כלל עבור הרמפרודיטים ולא עבור זכרים. הרמפרודיטים המזדווגים חיים קצרים יותר מבעלי חיים לא ממומשים, אפילו בנוכחות FUdR. הזכרים קטנים ודקים יותר מהרמפרודיטים וניתן לזהותם בקלות על ידי זנב מכור ייחודי. - תחזיר את הקופסה לשקית הנעילה. חזור לאינקובטור 20 מעלות צלזיוס.
2. הכדאיות הניקוד
- ציון הכדאיות מדי יום על ידי נגיעה עדינה של החיה על הראש עם חוט פלטינה או ריס. ציון בעלי חיים שאינם מצליחים לנוע כמתים ולהסיר אותם מהצלחת (איור 1A). רשום את המספר שנצפה מת עבור כל תנאי עבור כל נקודת זמן תצפית.
שים לב: כדי להפחית את הסיכון להטיית ניקוד, על הנסיין להישאר עיוור לתנאים ניסיוניים ואסור לו להתייחס לתוצאות מנקודות זמן קודמות במהלך הניקוד. - צנזר בעלי חיים שנקרעים, מתים מפגמי התפתחות ברורים אחרים, או זוחלים בצד המנה: מוציאים את בעלי החיים האלה ומתעדים את המספר בכל נקודת זמן שנצפתה לצורך התחשבות בניתוח הסטטיסטי. בנוסף, אם זכרים נמצאים, להסיר אותם ולתעד את המספר שנצפה.
- חזרו על הפעולה משלב 2.1 מדי יום עד שלא יישארו בעלי חיים בחיים.
שים לב: אם הדשא של E. coli פוחת באופן משמעותי או פטרייה מתחילה לגדול על הצלחת, להעביר את כל בעלי החיים הנותרים לצלחת טרייה עם RNAi המתאים FUdR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1: שיטת ערכת העותקים המשוכפלים המסורתית והמשוכפלת לניקוד תוחלת החיים של C.elegans (A). השיטה המסורתית לניקוד C. elegans תוחלת חיים. מספר אוכלוסיות מסונכרנות קטנות של בעלי חיים isogenic לכל תנאי הם אחריו לאורך זמן. אותה אוכלוסייה של בעלי חיים מלווה לאורך כל קורס הלימודים. הכדאיות מוערכת על ידי תנועה, אשר עשוי להיות מגורה על ידי דרבון עדין. בעלי חיים שאינם מצליחים לזוז הם הבקיע כמתים והם הוסרו (שאיפה מוצגת) עד שלא נשארו בעלי חיים קיימא. (ב. שיטת ערכת העותקים המשוכפלים עבור ניקוד C. elegans תוחלת חיים. אוכלוסייה גדולה של בעלי חיים איסוגניים מסונכרנים לגיל מופצים על פני מספר לוחות משכפלים זהים. בכל נקודת זמן, שכפול יחיד הוא הבקיע: פתרון אגירה קלה (M9) מתווסף, אשר מגרה תנועה. בעלי חיים שאינם מצליחים לנוע באופן ספונטני לאחר הצפת בארות מוערכים גם באמצעות גירוי מגע. משך הניקוד של הניסוי נקבע לפני ההתחלה. כל בעל חיים ניקוד רק פעם אחת ואריכות ימים עבור האוכלוסייה הגדולה נגזר תצפיות עצמאיות רבות. (ג. גישת קבוצת העותקים המשוכפלים היא שיטת תפוקה גבוהה למדידה כמותית של תוחלת החיים של C. elegans. ניתן לעקוב אחר 100 שיבוטי RNAi עצמאיים או יותר בו זמנית. HT115 E. coli המביע dsRNA עבור שיבוט RNAi נתון מוצג. למעשה, כל 24 דגימות מהצלחת של 96 באר מחולקות לצלחת אחת של 24 באר. לכל צלחת 24 באר וכתוצאה מכך יש שלילי(כלומר וקטור ריק, באר אדומה) ושליטה חיובית (באר ירוקה) מופץ באופן אקראי בתוך אוסף של שיבוטים RNAi (בארות צהובות). בדרך כלל, הבאר הראשונה (A1) באוסף מכילה וקטור ריק. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FuDR (5-Fluoro-2'-deoxyuridine) | Alfa Aesar | L16497 | |
| 24 Well Culture Plates | Greiner Bio-One | #662102 | |
| 600 µL 96-well plates | Greiner Bio-One | #786261 | |
| 2mL 96-well plates | Greiner Bio-One | #780286 | |
| 96-pin plate replicator | Nunc | 250520 | |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Ahringer | Source Bioscience | C. elegans RNAi Collection (Ahringer) | See also Kamath et. al, Nature 2003. |
| C. elegans RNAi clone library in HT115 bacteria- Vidal | Source Bioscience | C. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal) | See also Rual et. al, Genome Research 2004. This library is also available from Dharmacon. |
| L4440 Empty Vector Plasmid | Addgene | 1654 | https://www.addgene.org/1654/ |
