Summary

Лазерная Захват микродиссекции Drosophila Периферийные Нейроны

Published: May 24, 2010
doi:

Summary

В этом видео-работе предлагается метод выделения одной или нескольких<em> Drosophila</em> Да нейроны от третьего возраста личинок через ИК-захвата (ИК) класса лазерной Захват микродиссекция (LCM). РНК получена из изолированных нейронов могут быть легко использованы для последующих применений, включая QRT-PCR или микрочипов анализа.

Abstract

Дендритные разветвление (да) нейронов дрозофилы периферической нервной системы (ПНС) обеспечивают отличную модель системы, в которой для расследования молекулярные механизмы, лежащие класса конкретных дендритов морфогенеза 1,2. Для облегчения молекулярный анализ класса конкретных да нейрона развития, жизненно важно, чтобы получить эти клетки в чистое населения. Хотя спектр различных клетки, ткани и конкретных методов изоляции РНК существуют для клеток дрозофилы, в том числе магнитные бусины основанные очистки ячейки 3,4, флуоресцентная Активированный сортировки клеток (FACS) 5-8, и РНК, белок стратегий 9, ни одна из эти методы могут быть легко использованы для выделения одного или нескольких классов конкретных дрозофилы да нейронов с высокой степенью пространственной точностью. Лазерная Захват микродиссекция (LCM) стала чрезвычайно мощный инструмент, который может быть использован для выделения специфических типов клеток из ткани участки с высокой степенью пространственного разрешения и точности. РНК получена из изолированных клеток могут быть использованы для анализа в том числе QRT-PCR и микрочипов профилирование экспрессии в течение определенного типа клеток 10-16. На сегодняшний день, НОК не была широко применяются в анализе тканей и клеток дрозофилы 17,18, в том числе да нейронов на третьем личиночного возраста стадии развития.

Здесь мы представляем наш оптимизированный протокол для изоляции нейронов дрозофилы да использованием инфракрасного (ИК) класс LCM. Этот метод позволяет захватывать одиночных, классовые или нескольких да нейроны с высокой специфичностью и пространственным разрешением. Возраст соответствием третьего возраста личинок выражения UAS-mCD8:: GFP 19 трансгенов, находящихся под контролем либо класс IV-да-нейрон конкретных ППК-GAL4 20 водителя или пан-да-нейрон конкретных 21-7-21 GAL4 водитель были использованы для этих экспериментов. РНК получена из изолированных нейронов, да очень высокого качества и могут быть непосредственно использованы для последующих применений, включая QRT-PCR или микрочипов анализа. Кроме того, этот протокол LCM могут быть легко приспособлены для захвата другой клетки дрозофилы типов различных этапах развития зависит от типа клеток конкретных, GAL4 управляемой выражение структуры GFP.

Protocol

Общие замечания по НОК дрозофилы периферических нейронов Позвольте от 6 часов до недели или дольше для LCM в зависимости от типа ткани и количества клеток требуется. Все процедуры проводятся в строго РНКазы без условий следующие стандартные процедуры….

Discussion

Протокол, представленные здесь описывает наш оптимизированный метод изоляции дрозофилы периферические нейроны через LCM. Хотя этот протокол LCM был разработан для конкретной изоляции одного, конкретного класса или нескольких нейронов дрозофилы да от третьего возраста личино?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим доктора. Yuh-Нунг Ян и Уэс Grueber за предоставление летать запасы, используемые в этом исследовании, и Вирджиния Эспина, доктор Эмануэль Petricoin и доктор Ланс Лиотта за помощью в НОК. Авторы признают, Томас Ф. и Кейт Миллер Джеффресс Мемориального Фонда за поддержку этого исследования (РСК) и Университета Джорджа Мейсона проректор Офис (EPRI).

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)   MP Bioproducts PBS10X02 Diluted to 1X working solution
2.5% Trypsin   Sigma-Aldrich T1426  
RNase-AWAY   Sigma-Aldrich 83931  
Xylenes, histological grade   Fisher Scientific X3S-4  
RNAse-free water   Fisher Scientific BP561-1  
Optimal Cutting Temperature (OCT) compound   Tissue-Tek 4583  
PicoPure RNA Isolation Kit   Molecular Devices KIT0204 Follow manufacturer’s instructions
Thin walled reaction tube with domed cap   GeneAmp, Applied Biosystems N8010611  
ExtracSure Sample Extraction Device   Molecular Devices LCM 0208  
Incubation Block for sample extraction from CapSure HS Caps   Molecular Devices LCM0505  
Alignment Tray for CapSure HS LCM Caps and ExtracSure Sample Extraction Devices   Molecular Devices LCM0504  
CapSure HS LCM caps   Molecular Devices LCM0213  
75×100 mm glass slides   Fisher Scientific 12-544-3  
Tissue embedding molds   Fisher Scientific NC9642669  
Polypropylene pestle for 1.5 ml microcentrifuge tubes   USA Scientific 1415-5390  
70% Ethanol; 95% Ethanol; 100% Ethanol        
Dry ice        

Equipment:

  • Cryostat
  • 50 ml conical tube for slide fixation, rinsing, trypsin treatment and ethanol/xylene dehydration
  • -80°C freezer
  • Incubator
  • PixCell IIe LCM Instrument with Fluor 300 epifluorescence optics optimized for EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)

References

  1. Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
  2. Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
  3. Wang, X., Starz-Gaiano, M., Bridges, T., Montell, D. Purification of specific cell populations from Drosophila tissues by magnetic bead sorting, for use in gene expression profiling. Nature Protocols. , (2008).
  4. Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. Isolation and purification of Drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting. J Vis Exp. 34, 2912-2917 (2004).
  5. Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).
  6. Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry. Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).
  7. Reeves, N., Posakony, J. W. Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS. Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).
  8. Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
  9. Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging. Nucl. Acids Res. 33, (2005).
  10. Appay, V. Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages. J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).
  11. Ginzinger, D. G. Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream. Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).
  12. Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification. J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).
  13. Volgin, D. V., Swan, J., Kubin, L. Single-cell RT-PCR gene expression profiling of acutely dissociated and immunocytochemically identified central neurons. J. Neurosci. Methods. 136, 229-236 (2004).
  14. Emmert-Buck, M. R. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
  15. Xiao, W. Gene expression profiling in embryonic mouse lenses. Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).
  16. Scharschmidt, T. Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR. Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).
  17. Spletter, M. L. regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity. Neural Dev. 2, 14-14 (2007).
  18. Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning. J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).
  19. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  20. Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
  21. Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).
  22. Espina, V. Laser capture microdissection. Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25, 402-408 (2001).

Play Video

Cite This Article
Iyer, E. P. R., Cox, D. N. Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons. J. Vis. Exp. (39), e2016, doi:10.3791/2016 (2010).

View Video