Summary

Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen

Published: May 24, 2010
doi:

Summary

In diesem Video-Artikel präsentieren wir eine Methode zur Isolierung von einzelnen oder mehreren<em> Drosophila</em> Da Neuronen aus dritten Larvenstadium mit der Infrarot-Aufnahme (IR)-Klasse von Laser Capture Mikrodissektion (LCM). RNA aus den isolierten Neuronen erhalten können leicht für nachgelagerte Anwendungen wie qRT-PCR oder Microarray-Analysen verwendet werden.

Abstract

Die dendritischen Verzweigung (da) Neuronen des Drosophila peripheren Nervensystem (PNS) liefern ein hervorragendes Modell, in dem die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen klassenspezifischen Dendriten Morphogenese 1,2 untersuchen. Zur Erleichterung der molekularen Analyse von klassenspezifischen da Neuron Entwicklung ist es wichtig, diese Zellen in eine reine Population zu erhalten. Obwohl eine Reihe von verschiedenen Zell-und Gewebe-spezifische RNA-Isolierung Techniken existieren für Drosophila-Zellen, einschließlich Magnetic-Bead-basierten Zellreinigung 3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) 5-8, und RNA bindenden Proteins Strategien 9, keine Diese Methoden können leicht zur Isolierung von einzelnen oder mehreren Klassen-spezifischen Drosophila da Neuronen mit einem hohen Grad an räumlicher Präzision eingesetzt werden. Laser Capture Mikrodissektion (LCM) wurde als ein äußerst leistungsfähiges Werkzeug, das benutzt, um bestimmte Zelltypen aus Gewebeschnitten isoliert mit einem hohen Grad an räumlicher Auflösung und Genauigkeit kann entstanden. RNA aus isolierten Zellen erhalten kann dann für Analysen einschließlich qRT-PCR und Microarray-Expression Profiling innerhalb einer bestimmten Zelltyp 10-16 verwendet werden. Bis heute hat LCM nicht umfassend in die Analyse von Drosophila Gewebe und Zellen 17,18, einschließlich da Neuronen an der dritten Larvenstadium Larvenstadium der Entwicklung eingesetzt.

Hier präsentieren wir unsere optimiertes Protokoll für die Isolierung von Drosophila da Neuronen mit der Infrarot-(IR)-Klasse von LCM. Diese Methode ermöglicht die Erfassung von Einzel-, Klassen-spezifischen oder mehrere da Neuronen mit hoher Spezifität und räumlicher Auflösung. Alter abgestimmten dritten Larvenstadium Ausdruck eines UAS-mCD8:: GFP 19 Transgen unter der Kontrolle von entweder der Klasse IV da Neuron spezifischen ppk-GAL4 20 Treiber oder in den gesamteuropäischen da Neuron spezifischen 21-7-GAL4 21 Treiber wurden für diese verwendet Experimente. RNA aus den isolierten da Neuronen erhalten ist von sehr hoher Qualität und kann direkt für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich qRT-PCR oder Microarray-Analysen verwendet werden. Darüber hinaus kann diese LCM-Protokoll leicht angepasst werden, zu erfassen anderen Drosophila Zelltypen eine verschiedene Stadien der Entwicklung abhängig vom Zelltyp spezifisch, GAL4-driven Expressionsmuster von GFP.

Protocol

Allgemeine Bemerkungen zum LCM von Drosophila peripheren Neuronen Allow from 6 Stunden, bis zu einer Woche oder länger für LCM je nach Gewebetyp und die Anzahl der Zellen erforderlich. Alle Verfahren sind in streng RNase-freien Bedingungen gemäß Standardverfahren durchgeführt. Larven, die entweder 21-7-GAL4, UAS-mCD8:: GFP oder ppk-GAL4, UAS-mCD8:: GFP transgenen Reporter Linien wurden für diese Experimente verwendet. <p class="…

Discussion

Das Protokoll hier vorgestellte beschreibt unsere optimierte Methode zur Isolierung von Drosophila peripheren Neuronen über LCM. Während dieser LCM-Protokoll für die spezifische Isolierung von Einzel-, Klassen-spezifischen oder mehrere Drosophila da Neuronen ab dem dritten Larvenstadium Larvenstadium der Entwicklung konzipiert wurde, konnte geringfügige Änderungen des Protokolls ohne weiteres für den Fang von anderen Drosophila Zelltypen aus allen Entwicklungs angepasst werden Phasen mit…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Drs. Yuh-Nung Jan und Wes Grueber für die Bereitstellung von fly Aktien in dieser Studie verwendet wird, und Virginia Espina, Dr. Emanuel Petricoin und Dr. Lance Liotta für die Unterstützung bei LCM. Die Autoren danken Thomas F. und Kate Miller Jeffress Memorial Trust für die Unterstützung dieser Forschung (DNC) und der George Mason University Provost s Office (EPRI).

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)   MP Bioproducts PBS10X02 Diluted to 1X working solution
2.5% Trypsin   Sigma-Aldrich T1426  
RNase-AWAY   Sigma-Aldrich 83931  
Xylenes, histological grade   Fisher Scientific X3S-4  
RNAse-free water   Fisher Scientific BP561-1  
Optimal Cutting Temperature (OCT) compound   Tissue-Tek 4583  
PicoPure RNA Isolation Kit   Molecular Devices KIT0204 Follow manufacturer’s instructions
Thin walled reaction tube with domed cap   GeneAmp, Applied Biosystems N8010611  
ExtracSure Sample Extraction Device   Molecular Devices LCM 0208  
Incubation Block for sample extraction from CapSure HS Caps   Molecular Devices LCM0505  
Alignment Tray for CapSure HS LCM Caps and ExtracSure Sample Extraction Devices   Molecular Devices LCM0504  
CapSure HS LCM caps   Molecular Devices LCM0213  
75×100 mm glass slides   Fisher Scientific 12-544-3  
Tissue embedding molds   Fisher Scientific NC9642669  
Polypropylene pestle for 1.5 ml microcentrifuge tubes   USA Scientific 1415-5390  
70% Ethanol; 95% Ethanol; 100% Ethanol        
Dry ice        

Equipment:

  • Cryostat
  • 50 ml conical tube for slide fixation, rinsing, trypsin treatment and ethanol/xylene dehydration
  • -80°C freezer
  • Incubator
  • PixCell IIe LCM Instrument with Fluor 300 epifluorescence optics optimized for EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)

References

  1. Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
  2. Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, ., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
  3. Wang, X., Starz-Gaiano, M., Bridges, T., Montell, D. Purification of specific cell populations from Drosophila tissues by magnetic bead sorting, for use in gene expression profiling. Nature Protocols. , (2008).
  4. Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. Isolation and purification of Drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting. J Vis Exp. 34, 2912-2917 (2004).
  5. Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).
  6. Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry. Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).
  7. Reeves, N., Posakony, J. W. Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS. Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).
  8. Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
  9. Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging. Nucl. Acids Res. 33, (2005).
  10. Appay, V. Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages. J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).
  11. Ginzinger, D. G. Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream. Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).
  12. Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification. J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).
  13. Volgin, D. V., Swan, J., Kubin, L. Single-cell RT-PCR gene expression profiling of acutely dissociated and immunocytochemically identified central neurons. J. Neurosci. Methods. 136, 229-236 (2004).
  14. Emmert-Buck, M. R. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
  15. Xiao, W. Gene expression profiling in embryonic mouse lenses. Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).
  16. Scharschmidt, T. Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR. Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).
  17. Spletter, M. L. regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity. Neural Dev. 2, 14-14 (2007).
  18. Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning. J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).
  19. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  20. Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
  21. Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).
  22. Espina, V. Laser capture microdissection. Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25, 402-408 (2001).

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Cite This Article
Iyer, E. P. R., Cox, D. N. Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons. J. Vis. Exp. (39), e2016, doi:10.3791/2016 (2010).

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