Calcium imaging: een methode om neurale activiteit in levende C. elegans te visualiseren

Abstract

Bron: Turek, M. et al. Agarose Microchambers voor lange termijn calcium beeldvorming van Caenorhabditis elegans. J.Vis. Exp. (2015). 

Deze video introduceert de concepten achter calciumbeeldvorming en bevat een voorbeeldprotocol voor time-lapse beeldvorming van wormen in gegoten agaroseputten.

Protocol

Dit protocol is een uittreksel uit Turek et al, Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).

1. Calcium beeldvorming

1. Gebruik transgene stammen die genetisch gecodeerde calciumsensoren zoals HBR16 uitdrukken (goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)]).
2. Gebruik een samengestelde microscoop die is uitgerust voor breedveldepifluorescentie. Sluit de TTL-uitgang van de EMCCD-camera aan op de TTL-ingang van de LED, zodat telkens wanneer de camera een frame opneemt, het monster wordt verlicht. Gebruik een belichtingstijd van ongeveer 5 msec. Gebruik EM gain in het bereik van 50 - 300.
3. Geef een burst-film op die 24 uur draait, waarbij elke worm elke 15 - 30 minuten wordt afgebeeld, eerst gedurende 20 seconden met DIC, vervolgens gedurende 20 seconden met een GFP-fluorescentie om GCaMP op te nemen en maak vervolgens een laatste afbeelding van het mKate2-signaal dat wordt genomen om te bepalen voor expressieniveaus. Gebruik een framesnelheid van 2/sec tijdens elke burst.
4. Gebruik voor visuele gegevensinspectie een kaart met valse kleuren om de zichtbaarheid van kleine veranderingen in fluorescentie-intensiteit te verbeteren. Plot fluorescerende gegevens als ΔF/F, waarbij F de gemiddelde basiswaarde van fluorescentie is. Een gedetailleerde beschrijving van calciumgegevensanalyse is te vinden in de literatuur.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LED system	CoolLED	pE-2
Compound microscope	Nikon	TiE
EMCCD camera	Andor	iXon 897	now sold as iXon Ultra 897
Z-stage for the microscope	Prior	Nano Scan Z
X-Y stage for the microscope	Prior	Proscan III
Red light filter	Chroma	ET660/50m
35 mm Petri dish	Falcon	Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning