Calcium imaging: een methode om neurale activiteit in levende C. elegans te visualiseren

Overview

Deze video introduceert de concepten achter calciumbeeldvorming en bevat een voorbeeldprotocol voor time-lapse beeldvorming van wormen in gegoten agaroseputten.

Protocol

Dit protocol is een uittreksel uit Turek et al, Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).

1. Calcium beeldvorming

1. Gebruik transgene stammen die genetisch gecodeerde calciumsensoren zoals HBR16 uitdrukken (goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)]).
2. Gebruik een samengestelde microscoop die is uitgerust voor breedveldepifluorescentie. Sluit de TTL-uitgang van de EMCCD-camera aan op de TTL-ingang van de LED, zodat telkens wanneer de camera een frame opneemt, het monster wordt verlicht. Gebruik een belichtingstijd van ongeveer 5 msec. Gebruik EM gain in het bereik van 50 - 300.
3. Geef een burst-film op die 24 uur draait, waarbij elke worm elke 15 - 30 minuten wordt afgebeeld, eerst gedurende 20 seconden met DIC, vervolgens gedurende 20 seconden met een GFP-fluorescentie om GCaMP op te nemen en maak vervolgens een laatste afbeelding van het mKate2-signaal dat wordt genomen om te bepalen voor expressieniveaus. Gebruik een framesnelheid van 2/sec tijdens elke burst.
4. Gebruik voor visuele gegevensinspectie een kaart met valse kleuren om de zichtbaarheid van kleine veranderingen in fluorescentie-intensiteit te verbeteren. Plot fluorescerende gegevens als ΔF/F, waarbij F de gemiddelde basiswaarde van fluorescentie is. Een gedetailleerde beschrijving van calciumgegevensanalyse is te vinden in de literatuur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LED system	CoolLED	pE-2
Compound microscope	Nikon	TiE
EMCCD camera	Andor	iXon 897	now sold as iXon Ultra 897
Z-stage for the microscope	Prior	Nano Scan Z
X-Y stage for the microscope	Prior	Proscan III
Red light filter	Chroma	ET660/50m
35 mm Petri dish	Falcon	Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning