Overview
Это видео вводит понятия, стоящие за кальция изображений и включает в себя пример протокола для замедленной визуализации червей, содержащихся в формованных скважин агарозы.
Protocol
Этот протокол является выдержкой из Turek и др., Агарозы Microchambers для долгосрочного кальция Изображения Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).
1. Изображение кальция
- Используйте трансгенные штаммы, выражаюющие генетически закодированные датчики кальция, такие как HBR16(goeIs5'pnmr-1:SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119).).
- Используйте сложный микроскоп, оборудованный для широкой эпифлюоресценции. Подключите выход TTL камеры EMCCD к вводу TTL светодиода, так что каждый раз, когда камера записывает кадр, образец будет освещаться. Используйте время экспозиции около 5 мсек. Используйте ПРИРОСТ в диапазоне от 50 до 300.
- Укажите взрыв фильм работает в течение 24 часов с каждым червем время изображены каждые 15 - 30 минут сначала в течение 20 сек с DIC, а затем в течение 20 сек с флуоресценцией GFP для записи GCaMP, а затем принять окончательное изображение сигнала mKate2 принимается для контроля для уровней выражения. Используйте частоту кадров 2/sec во время каждого всплеска.
- Для проверки визуальных данных используйте карту ложного цвета для повышения видимости небольших изменений интенсивности флуоресценции. Участок флуоресцентных данных, как F / F, с F является среднее базовое значение флуоресценции. Подробное описание анализа данных кальция можно найти в литературе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LED system | CoolLED | pE-2 | |
| Compound microscope | Nikon | TiE | |
| EMCCD camera | Andor | iXon 897 | now sold as iXon Ultra 897 |
| Z-stage for the microscope | Prior | Nano Scan Z | |
| X-Y stage for the microscope | Prior | Proscan III | |
| Red light filter | Chroma | ET660/50m | |
| 35 mm Petri dish | Falcon | Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning |
