Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Laser Capture Microdissection av Drosophila Neuron

doi: 10.3791/2016 Published: May 24, 2010

Summary

I denna video-artikeln presenterar vi en metod för att isolera enstaka eller flera

Abstract

Den dendritiska arborization (DA) nervceller i Drosophila perifera nervsystemet (PNS) ger en utmärkt modell system där för att undersöka de molekylära mekanismerna bakom klasspecifika 1,2 Dendrite morfogenes. För att underlätta molekylära analyser av klass-specifika da neuron utveckling är det viktigt att få dessa celler i en ren population. Även om en rad olika celler och vävnad-specifika RNA-tekniker isolering finns för Drosophila celler, inklusive magnetisk pärla baserat cell rening 3,4, Lysrör Aktiverat cellsortering (FACS) 5-8, och RNA-bindande protein strategier 9, ingen av dessa metoder kan lätt utnyttjas för att isolera en eller flera klass-specifika Drosophila da nervceller med en hög grad av rumslig precision. Laser Capture Microdissection (LCM) har visat sig vara ett mycket kraftfullt verktyg som kan användas för att isolera specifika celltyper från vävnadssnitt med en hög grad av rumslig upplösning och noggrannhet. RNA från isolerade celler kan sedan användas för analyser, inklusive QRT-PCR och microarray expression profiling inom viss celltyp 10-16. Hittills har LCM inte i stor utsträckning i analysen av Drosophila vävnader och celler 17,18, inklusive da nervceller vid den tredje INSTAR larvstadiet i utvecklingen.

Här presenterar vi våra optimerat protokoll för isolering av Drosophila da nervceller med hjälp av den infraröda (IR) klass av LCM. Denna metod gör det möjligt för fångst av enstaka, klass-specifika eller flera da nervceller med hög specificitet och rumslig upplösning. Åldersmatchade third INSTAR larver som uttrycker en YH-mCD8:: GFP 19 transgenen under kontroll av antingen klass IV da neuron specifika PPK-GAL4 20 förare eller den pan-da neuron specifika 21-7-GAL4 21 förare har använts för dessa experiment. RNA från den isolerade da nervceller är av mycket hög kvalitet och kan användas direkt för nedströms tillämpningar, inklusive QRT-PCR och microarray-metoder. Dessutom kan denna LCM protokoll vara lätt anpassas för att fånga andra Drosophila celltyper en olika stadier av utveckling beroende av celltyp specifika, GAL4 driven uttryck mönster av GFP.

Protocol

Allmänna kommentarer om LCM av Drosophila neuron

Låt från 6 timmar upp till en vecka eller längre för LCM beroende på vävnadstyp och antalet nödvändiga celler.

Alla förfaranden utförs i strikt RNAse-fria förhållanden efter standardförfaranden. Larver som antingen uttrycker 21-7-GAL4, UAS-mCD8:: GFP eller PPK-GAL4, UAS-mCD8:: GFP transgena reporter linjer används för dessa experiment.

1. Förbereda larver

  1. Samla 30-40 åldersmatchade third INSTAR larver och tvätta dem i DDH 2 O följt av korta sköljningar i RNAse Borta (Sigma-Aldrich), och en slutlig tvätta i DDH 2 O att ta bort RNAse bort. Wick av överskott DDH 2 O helt med en ren Kimwipe före bädda in larver i oktober
  2. Ta en ren form vävnad inbäddning och lagret den med en tunn (1,5-2mm) lager av oktober, precis tillräckligt för att täcka ett enda lager av larver.
  3. Innan bädda larverna, om det behövs, kyla oktober till 0 ° C i vävnaden inbäddning formar. Gör detta genom att placera formen med oktober på ett isblock. Detta kommer att bidra till att minska larver rörelsen under inbäddning processen.
  4. Placera de rena larverna på den nedkylda oktober och arrangera dem parallellt med varandra. När larverna har arrangerats, sakta fylls formen med oktober utan att störa larver arrangemanget. Snap frysa formen genom att placera den på en torr isblock. [Avgörande steg:. Snap-frysa larverna omedelbart för att minska rörelsen] Denna metod gör det möjligt för larverna att vara i en enda plan, maximera antalet celler tillgängligt per avsnitt för att fånga.

Om det är nödvändigt att bevara vävnaden morfologi för att identifiera celler av intresse, eller om det förväntade antalet celler per avsnitt befinns vara tillfredsställande sedan vidare direkt till steg 11.

Alternativt, om cellerna är märkta specifikt och kan identifieras med en lätt identifierbar markör som GFP eller RFP, men antalet celler per avsnitt visar sig vara låg, då steg från 05 till 10 maj vara till hjälp för att öka antalet celler som finns för att fånga per avsnitt. Dessa är frivilliga åtgärder och bör endast övervägas om det behövs, som en metod för att öka antalet da nervceller tillgängliga för LCM per avsnitt när den andra metoden inte ger goda resultat. [Observera: Denna metod kan störa den allmänna vävnaden morfologi och gör vävnaden identifiering baserat på specifika geografiska läge, mycket svårt.]

  1. Tvätta 50-70 third INSTAR larver som beskrivs i steg 1. Placera larver i en 1,5 ml mikrofugrör innehåller 500 ìl RNAse gratis 1X PBS.
  2. Dounce larverna med en polypropylen mortelstöt (USA Scientific), med 6-7 långsamma kraftiga drag.
  3. Centrifugera lösningen vid 16 tusen (x) g under 50-10 sekunder (tills larvala nagelbanden sig ner till botten av mikrofugrör]. Kassera supernatanten. Den pellets ska främst bestå av larver nagelband som PNS, inklusive da nervceller är tätt följs.
  4. Tvätta nagelbanden pellets 2-3 gånger i 1X PBS och suspendera pelleten i 500 l 1X PBS. Snurra lösning vid 16 tusen (x) gi 1 minut för att bilda en kompakt pelletspanna. Aspirera supernatanten helt med en fin pasteurpipett.
  5. Ta försiktigt bort pellets ur mikrofugrör med en ren spatel, och veken bort överskottet PBS med en ren Kimwipe vävnad. [OBS: Det är viktigt att hålla pellets så kompakt som möjligt för att öka cellen avkastningen]. Placera kompakta nagelband pelleten på en plastform som innehåller ett tunt lager av oktober (1 mm ca).
  6. Försiktigt utspridda pelleten i en tunn cirkulär yta. Fyll formen med oktober, och frysa vävnaden som beskrivs i steg 4.
  7. Med hjälp av en kryostat, skär frysta snitt på 5-8 ìm tjocklek på vanligt märkt,, oladdade, RNAse gratis diabilder glas mikroskop. [Kritiska steget: Placera vävnadssnitt nära mitten av bilden.]
  8. Förvara bilderna antingen direkt på torris eller vid -80 ° C i en ren bild-box tills klar för microdissection. Utför LCM helst inom en vecka efter snittning av vävnaden.

Pause

2. Uttorkning och Cuticle Borttagning av fryst Larvernas § §

[Kritiska steget: Alla lösningar för uttorkning måste beredas på nytt inför varje LCM session. Komplett uttorkning av frysta larver vävnadssnitt är nödvändigt för att uppnå optimal microdissection effektivitet]

  1. Ta bilderna med de frysta larver vävnadssnitt från -80 ° C frys och placera dem på torr-is.
  2. Ta bort en enda bild från torris och omedelbart placera den direkti ett 50 ml koniskt rör fyllt med 70% etanol fixativ, följt av en kort sköljning i RNAse gratis DDH 2 O enligt rekommenderad tid presenteras i tabell 1.
  3. Förekomsten av larver nagelband i frysta snitt kan försämra uppsamlingskapacitet genom att förhindra effektiv LCM cap-cell kontakt som kan leda till icke-specifik fånga. Vid behov utföra följande steg (4-5) för att rensa nagelbanden från vävnadssnitt.
  4. Försiktigt pipett 50 ìl 2,5% trypsin direkt på vävnadssnitt och inkubera i 50-30 sekunder vid rumstemperatur. [Kritiskt steg: Detta steg kan kräva optimering. Inkubationstiden beror på att vävnaden ska microdissected och avsnitt tjocklek. Längre inkubation kan rensa allt, inklusive de celler av intresse, medan en kort inkubationstid kan vara otillräckliga för att ta bort nagelbanden]
  5. Skölj delarna kort stund i en 50 ml koniska rör med RNAse-fri DDH 2 O att ta bort trypsin, samt löst följs fragment nagelband.
  6. Doppa dem sekventiellt i varje återstående etanol och xylen lösningar för de rekommenderade gånger (tabell 1) för att slutföra uttorkning processen.
  7. Efter uttorkning lutning, är bilderna kortfattat torkas under en mild luftström för 60-120 sekunder i rumstemperatur innan du utför LCM. [Observera: Torka xylen helt från vävnadssnitt innan du utför LCM. Xylen är känt för att upplösa LCM locket polymeren ger microdissection fel].
70% etanol (Fixative) 3-10 sekunder
DDH 2 O 5-10 sekunder
2,5% Trypsin Inkubering 5-30 sekunder
DDH 2 O 5-10 sekunder
70% etanol 60 sekunder
95% etanol 60 sekunder
100% etanol 120 sekunder
100% etanol 120 sekunder
100% Xylen 120 sekunder
100% Xylen 120 sekunder
Lufttorka i en mild luftström 60-120 sekunder

Tabell 1: Rekommenderad procedur för LCM uttorkning av frysta larver vävnadssnitt.

3. Laser Capture Microdissection

PixCell IIe LCM instrumentet utrustat med Fluor 300 epifluorescence optik optimerade för EGFP användes för att utföra LCM.

[Kritiska steget: Om möjligt, utför microdissection i en luftfuktighet kontrollerad utrymme för att förhindra någon minskning microdissection verkningsgrad på grund av ökad luftfuktighet. Rummets luftfuktighet är en kritisk faktor som påverkar microdissection effektivitet. Låg rum luftfuktighet kan orsaka en ökad statisk elektrostatiska resulterar i icke-specifik fånga, medan höga rummets luftfuktighet kan resultera i lågt microdissection effektivitet. Vi uppnådde optimal LCM verkningsgrad mellan 25-50% relativ luftfuktighet.]

  1. Slå på strömmen till mikroskop och laser kontrollbox.
  2. Ladda CapSure montering keps hållare med HS LCM lock (Molecular Devices): Två patroner av LCM lock kan laddas samtidigt.
  3. Öppna Molecular Devices mjukvara och ange experimentet detaljer som bildnumret och Cap partinummer.
  4. Sätt i ett nytt HS LCM mössa från kassetten på PixCell IIe LCM instrumentet och placera den korrekt med avseende på joysticken för att säkerställa korrekt placering av den gemensamma jordbrukspolitiken i förhållande till fånga området.
  5. Placera objektglas innehåller färsk uttorkad larver vävnadssnitt på mikroskop scenen för microdissection.
  6. Leta reda på fluorescerande celler med okularen eller datorskärmen. På grund av den höga specificitet PPK-GAL4, UAS-mCD8:: GFP transgena reporter linje, kan klass IV da nervceller lätt identifieras av GFP fluorescens.
  7. Ämne vävnaden till LCM använda CapSure HS LCM caps [för en detaljerad uppsättning av instruktioner för inställning av instrumentet, med fokus laser och utföra LCM se referens 22].
  8. Justera "Power" och "Längd" laserpuls parametrar för att uppnå en exakt smält polymer plats, vars storlek motsvarar den valda laserpunkt storlek. Justera inställningarna för att anpassa storleken av smält polymer-området. Följande parametrar har använts för microdissecting enda klass IV da nervceller: Spotdiameter 7,5 ìm, laser styrka 30-50 mW, laser tid och 2-4 ms och 1-2 sHots per cell användes. [Avgörande steg: lasern parametrar som krävs för en ordentlig plats kan variera med vävnad tjocklek och rumsförhållanden luftfuktighet. Justera "Power" och "Längd" inställningar för att uppnå de nödvändiga smälta polymeren spot storlek för microdissecting en eller flera celler.]
  9. För att maximera specificitet, microdissect celler med minimal överlappning och en stark fluorescens. Varje mössa kan fånga många cell organ. [Kritiska steget: För att undvika RNA nedbrytning, begränsa den totala analysen tid inklusive uttorkning och microdissection till mindre än 45 minuter]
  10. När alla celler av intresse har fångats, lyfter HS LCM mössa med microdissected celler och placerade den på en ren bild för att bekräfta förekomsten av den fångade celler och visuellt inspektera tak för förekomst av oönskade celler eller skräp.

4. RNA isolering från LCM härledda celler

  1. Fäst locket innehåller microdissected celler till en ExtracSure (Molecular Devices) enhet. Tillsätt 12μl av RNA extraktionsbuffert (PicoPure, Molecular Devices) till den gemensamma jordbrukspolitiken ytan innehåller celler och anslut en inverterad tunnväggiga reaktionsrör (GeneAmp, Applied Biosystems) till ExtracSure enhet. Placera montering på en anpassning fack (Molecular Devices) och täck den med en inkubationstid block (Molecular Devices) förvärms till 42 ° C inne i en inkubator.
  2. Efter en 30 minuters inkubation, centrifugera rören innehåller extrakt på 800 (x) g i 2 minuter. Stäng rören och förvara cellen extrakt vid -80 ° C tills redo för RNA rening.

Pause

  1. Utdrag och kolumn rena RNA enligt PicoPure (Molecular Devices) RNA-extraktion kit instruktioner. DNAse behandling är frivillig och kan utföras på kolumnen under RNA rening som behövs. Vid behov kan flera LCM prover sammanförs under reningen i en enda kolumn för att öka den slutliga RNA avkastning och kan elueras i en liten volym (11-30 l) av eluering buffert (PicoPure, Molecular Devices) och förvaras vid -80 ° C fram till klar för användning. Om så önskas en 1 l alikvot kan användas för att bedöma total RNA kvalitet på en Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc.).

Representativa resultat

Laser fånga microdissection (LCM) användes för att isolera enstaka, klass-specifika eller flera Drosophila da nervceller från tredje INSTAR larver (figur 1). LCM tillåter en hög grad av precision och specificitet i isolering av Drosophila da neuron cell organ (Figur 2a-c). Dessutom var den totala RNA renas från dessa isolerade da nervceller visat sig vara av utmärkt kvalitet som framgår av förekomsten av skarpa 5.8S, 18S och 28S ribosomalt RNA toppar när de analyseras på en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) (Figur 2d).

För att bedöma neuronala-specifika anrikning av våra isolerade celler vi utförde i realtid av kvantitativ PCR omvänd transkription (QRT-PCR) med hjälp av neuronala genspecifika markör, elav. För QRT-PCR-analyser, beräknat vi de relativa nivåerna på elav uttryck i LCM microdissected da nervceller och normaliserade detta uttryck till att vår endogena kontroll (rp49) och i förhållande till total RNA isoleras från hela larver med ΔΔCt metod 23. Dessa analyser visade över 2,5 gånger anrikning i de relativa nivåerna på elav i LCM mikro-dissekerat da neuron prover jämfört med hela djur (Figur 3).

Figur 1
Figur 1: LCM av Drosophila perifera nervceller. (A) åldersmatchade third INSTAR larver är utvalda, tvättade och (b) inbäddad i ett cryomold med oktober och frysta vid -80 ° C, (c) 8μm seriell vävnadssnitt skapas med en vanlig kryostat och (d) placeras jämnt på rent glas diabilder. Glaset glider med anbringas vävnadssnitt lagras vid -80 ° C före LCM bearbetning. (E, f) som omedelbart föregår LCM, är vävnadssnitt tinade och kort fast i 70% etanol följt av korta skölj i DDH 2 O. (g) bilder är kortfattat inkuberas med trypsin och sköljas med DDH 2 O för att ta bort nagelbanden (svart) från larv avsnitt. (h, i) vävnadssnitt utan larver nagelband är sedan ytterligare uttorkad i en etanol lutning och slutligen godkännas i xylen . (j) LCM keps med en termolabila polymer placeras på vävnaden avsnitt och lasern är pulsad på den valda fluorescerande cellkroppen. Den laserpuls smälter polymer och omger den markerade cellen kroppen. Polymeren mössa, tillsammans med den fångade cellkroppen lyfts, och (k)

Figur 2
Figur 2: LCM möjliggör hög precision tillfångatagandet av da nervceller. (A) representant bild av en uttorkad och trypsin behandlade 8 § mikron vävnad innan du utför LCM, visar två klass-IV da nervceller märkta med GFP av PPK-GAL4, UASmCD8:: GFP reporter stam. Obs, är en av de nervceller markerade (pilspets) för att fånga. (B) cellkroppen av de markerade neuron (pilspets) är rent mikro-dissekeras med hög specificitet från vävnaden avsnitt. (C) Slutet på bild av en enda klass -IV da neuron fångas på LCM locket. (d) Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.) electropherogram av totala RNA isoleras från LCM-derived da nervceller, visar utmärkt RNA kvalitet som indikeras av närvaron av skarpa 5.8S, 18S och 28S rRNA toppar.

Figur 3
Figur 3:. QRT-PCR avslöjar betydande anrikning av neuronala markör genuttryck i LCM fångade da nervceller i förhållande till hela djuret QRT-PCR-analyser av neuron-specifik markör genuttryck (elav) i LCM fångade da nervceller (21-7-GAL4, YH-mCD8:: GFP) och hela djur i åldersmatchade third INSTAR larver utfördes i tre exemplar. Relativa nivåerna på elav uttryck i LCM fångade da nervceller normaliserades till den endogena kontrollen (rp49) och i förhållande till hela larver med ΔΔCt metod 23. En 2,5-faldig anrikning i de relativa nivåerna på elav i LCM fångade da neuron proverna observerades i förhållande till hela djur.

Felsökning

Problem: RNA bryts ner, eller av låg kvalitet.

Se till RNAse gratis skick under hela experimentet. Prova att minska mängden tid som läggs på LCM per bild till 30 minuter. Håll bilder och prover på torris, utom när de utför LCM. Undvik att tina vävnaden avsnitten när de klipps.

Problem: De flesta celler försvinner från bilden under trypsin behandling (steg 17-18).

Prova att minska tiden av trypsin behandling. Försök att minska trypsin koncentration.

Problem: Förekomst av nagelband och andra icke-specifik vävnad skräp på locket polymeren.

Prova att ta bort vävnaden skräp genom blotting polymeren yta med klibbiga sidan av klister not 22.

Problem: Låg LCM effektivitet.

Prova att öka inkubationstid på 100% etanol och xylener. Minska luftfuktigheten i rummet med hjälp av avfuktare.

Discussion

Protokollet presenteras här beskriver vår optimerad metod för isolering av Drosophila perifera nervceller via LCM. Även om detta LCM protokoll var utformad för det specifika isolering av enstaka, klass-specifika eller flera Drosophila da nervceller från den tredje INSTAR larvstadiet i utvecklingen, kan mindre ändringar av protokollet lätt anpassas för fångst av andra Drosophila celltyper från alla utvecklingsstudier skeden med olika GAL4, UAS-mCD8-GFP reporter transgener som etikett cellen eller de typer av intresse. Våra resultat visar att RNA från laser capture mikro-dissekerat da nervceller är av mycket hög kvalitet möjliggör för potentiella direkt användning i QRT-PCR och microarray-baserade analyser. Tillämpningar av detta protokoll sträcker sig längre än att fånga vildtyp celler av intresse som diskuterades här, där LCM kan användas i kombination med bortfall av funktion (UAS-RNAi) och / eller få-av-funktion studier Använda GAL4 / UAS-system i en cell typ av intresse.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Vi tackar Dr. Yuh-nung Jan och Wes Grueber för att ge flugan lager som används i denna studie, och Virginia Espina, Dr Emanuel Petricoin och Dr Lance Liotta för hjälp med LCM. Författarna erkänner Thomas F. och Kate Miller Jeffress Memorial Trust för att stödja denna forskning (DNC) och George Mason University Provost kansli (EPRI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) MP Biomedicals PBS10X02 Diluted to 1X working solution
2.5% Trypsin Sigma-Aldrich T1426
RNase-AWAY Sigma-Aldrich 83931
Xylenes, histological grade Fisher Scientific X3S-4
RNAse-free water Fisher Scientific BP561-1
Optimal Cutting Temperature (OCT) compound Tissue-Tek 4583
PicoPure RNA Isolation Kit Molecular Devices KIT0204 Follow manufacturer’s instructions
Thin walled reaction tube with domed cap Applied Biosystems N8010611
ExtracSure Sample Extraction Device Molecular Devices LCM 0208
Incubation Block for sample extraction from CapSure HS Caps Molecular Devices LCM0505
Alignment Tray for CapSure HS LCM Caps and ExtracSure Sample Extraction Devices Molecular Devices LCM0504
CapSure HS LCM caps Molecular Devices LCM0213
75x100 mm glass slides Fisher Scientific 12-544-3
Tissue embedding molds Fisher Scientific NC9642669
Polypropylene pestle for 1.5 ml microcentrifuge tubes USA Scientific, Inc. 1415-5390
70% Ethanol; 95% Ethanol; 100% Ethanol
Dry ice

Equipment:

  • Cryostat
  • 50 ml conical tube for slide fixation, rinsing, trypsin treatment and ethanol/xylene dehydration
  • -80°C freezer
  • Incubator
  • PixCell IIe LCM Instrument with Fluor 300 epifluorescence optics optimized for EGFP (Molecular Devices-Molecular Devices)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
  2. Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu. Rev. Neurosci. 30, 399-423 (2007).
  3. Wang, X., Starz-Gaiano, M., Bridges, T., Montell, D. Purification of specific cell populations from Drosophila tissues by magnetic bead sorting, for use in gene expression profiling. Nature Protocols. (2008).
  4. Iyer, E. P. R., Iyer, S. C., Sulkowski, M. J., Cox, D. N. Isolation and purification of Drosophila peripheral neurons by magnetic bead sorting. J Vis Exp. 34, 2912-2917 (2004).
  5. Tirouvanziam, R., Davidson, C. J., Lipsick, J. S., Herzenberg, L. A., Tirouvanziam, R., Tirouvanziam, R. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) of Drosophila hemocytes reveals important functional similarities to mammalian leukocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 2912-2917 (2004).
  6. Shigenobu, S., Arita, K., Kitadate, Y., Noda, C., Kobayashi, S. Isolation of germline cells from Drosophila embryos by flow cytometry. Dev. Growth Differ. 48, 49-57 (2006).
  7. Reeves, N., Posakony, J. W. Genetic programs activated by proneural proteins in the developing Drosophila PNS. Dev. Cell. 8, 413-425 (2005).
  8. Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and Cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
  9. Yang, Z., Edenberg, H. J., Davis, R. L. Isolation of mRNA from specific tissues of Drosophila by mRNA tagging. Nucl. Acids Res. 33, (2005).
  10. Appay, V. Sensitive Gene Expression Profiling of Human T Cell Subsets Reveals Parallel Post-Thymic Differentiation for CD4+ and CD8+ Lineages. J. Immunol. 179, 7406-7414 (2007).
  11. Ginzinger, D. G. Gene quantification using real-time quantitative PCR: An emerging technology hits the mainstream. Exp. Hematol. 30, 503-512 (2002).
  12. Keays, K. M., Owens, G. P., Ritchie, A. M., Gilden, D. H., Burgoon, M. P. Laser capture microdissection and single-cell RT-PCR without RNA purification. J. Immunol. Methods. 302, 90-98 (2005).
  13. Volgin, D. V., Swan, J., Kubin, L. Single-cell RT-PCR gene expression profiling of acutely dissociated and immunocytochemically identified central neurons. J. Neurosci. Methods. 136, 229-236 (2004).
  14. Emmert-Buck, M. R. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
  15. Xiao, W. Gene expression profiling in embryonic mouse lenses. Mol. Vis. 12, 1692-1698 (2006).
  16. Scharschmidt, T. Analysis of human osteoarthritic connective tissue by laser capture microdissection and QRT-PCR. Connect. Tissue Res. 48, 316-323 (2007).
  17. Spletter, M. L. regulates Drosophila olfactory projection neuron identity and targeting specificity. Neural Dev. 2, 14-14 (2007).
  18. Hoopfer, E. D., Penton, A., Watts, R. J., Luo, L. Genomic analysis of Drosophila neuronal remodeling: a role for the RNA-binding protein Boule as a negative regulator of axon pruning. J. Neurosci. 28, 6092-6103 (2008).
  19. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
  20. Grueber, W. B. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134, 55-64 (2007).
  21. Song, W., Onishi, M., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Peripheral multidendritic sensory neurons are necessary for rhythmic locomotion behavior in Drosophila larvae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 5199-5204 (2007).
  22. Espina, V. Laser capture microdissection. Nat. Prot. 1, 586-603 (2006).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25, 402-408 (2001).
Laser Capture Microdissection av<em> Drosophila</em> Neuron
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iyer, E. P. R., Cox, D. N. Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons. J. Vis. Exp. (39), e2016, doi:10.3791/2016 (2010).More

Iyer, E. P. R., Cox, D. N. Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons. J. Vis. Exp. (39), e2016, doi:10.3791/2016 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter