Overview
इस वीडियो में दो फोटॉन लेजर एक्सोटॉमी का उपयोग करके जेब्राफिश भ्रूण में अक्षों को घायल करने और चोट से अक्षीय वसूली को देखते हुए विधि का वर्णन किया गया है।
Protocol
1: एक कस्टम का उपयोग कर दो फोटॉन axotomy एक गिरगिट Ti-नीलमणि लेजर के साथ दो फोटॉन माइक्रोस्कोप का निर्माण
- इमेजिंग के लिए तैयार करें। एक स्लाइड धारक पर माउंटेड भ्रूण (एस) को माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। एक 40X (0.8 एनए) पानी उद्देश्य के साथ एक भ्रूण पर ध्यान केंद्रित। लेजर चालू करें। हम निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करके न्यूरॉन्स को व्यक्त करते हुए जीएफपी को पुन: कल्पना और क्षति पहुंचाने में सक्षम हैं। एक गैर हानिकारक शक्ति पर अक्षतंतु कल्पना करने के लिए, 910 नैनोमीटर (एनएम) की एक तरंग दैर्ध्य के लिए लेजर सेट और 30 मिलीवाट की शक्ति (mW सूचीबद्ध नमूने पर बिजली की मात्रा हैं)। इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें। हम करेल स्वोबोडा की प्रयोगशाला में विकसित स्कैनइमेज सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हैं।
- दो फोटॉन लेजर के साथ भ्रूण को स्कैन करने के लिए प्रेस फोकस करें, एक्सॉन का पता लगाएं जिसे आप एक्सोटॉमाइज करना चाहते हैं, और इस एक्सॉन की छवि को कैप्चर करें। पहले और अंतिम जेड पदों को चिह्नित करें, छवि प्राप्त करें, और जेड स्टैक का अधिकतम प्रक्षेपण करें।
- एक्सोन की शाखा पर 70X में ज़ूम करें जिसे आप एक्सोटॉमिज़ करना चाहते हैं और स्कैनिंग बंद करना चाहते हैं। 180 मिलियन की हानिकारक शक्ति के लिए नमूने पर एमडब्ल्यू बढ़ाएं, और लेजर के साथ एक स्कैन करें। हम जेड स्लाइस की संख्या 1 सेट करके और "ग्रैब" दबाकर ऐसा करते हैं। यह अक्षतंवर को तोड़ने के लिए पर्याप्त होना चाहिए। अपने माइक्रोस्कोप और प्रयोगात्मक लक्ष्य के लिए इस प्रक्रिया को अनुकूलित करने के तरीकों के लिए चर्चा देखें।
- ज़ूम आउट करें, 30 मीटर तक की शक्ति को कम करें और एक छवि लें।
2: Zeiss ५१० confocal/दो फोटॉन माइक्रोस्कोप पर दो फोटॉन axotomy
- मंच पर घुड़सवार भ्रूण रखें और इसे 25X पानी के उद्देश्य या अन्य उपयुक्त उद्देश्य का उपयोग करके ध्यान में लाएं।
- एक बहु-ट्रैक सेटिंग में दो फोटॉन (910 एनएम) और आर्गन (488 एनएम) लेजर चालू करें ताकि एक से दूसरे में स्विच करना संभव हो सके। हालांकि दोनों लेजर GFP का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है, दो फोटॉन उत्सर्जन लाल के साथ कल्पना की है, और हरे रंग के साथ आर्गन लेजर उत्सर्जन दो अंतर करने के लिए ।
- घायल करने के लिए एक अक्षतंपर की पहचान करने के लिए आर्गन लेजर का उपयोग करें। जेड सेटिंग्स के तहत पहले और आखिरी ऑप्टिकल सेक्शन को चिह्नित किया जाता है। एक कॉन्फोकल इमेज लें और जेड स्टैक का अधिकतम प्रक्षेपण बनाएं।
- घायल होने के लिए अक्षतंतरी के क्षेत्र का चयन करें और इस क्षेत्र को ध्यान में लाएं। आर्गन लेजर बंद करें और दो फोटॉन लेजर चालू करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि अक्षतंश अभी भी ध्यान में है, ~ 9% संचरण की लेजर तीव्रता पर दो फोटॉन के साथ नमूना स्कैन करें।
- "स्टॉप" बटन पर क्लिक करें ताकि फसल उपकरण उपलब्ध हो सके। ब्याज के क्षेत्र में ज़ूम करने के लिए फसल का उपयोग करें। आमतौर पर हम ~ 70X तक ज़ूम करते हैं (ज़ूम को "मोड" टैब के तहत चेक किया जा सकता है)। "चैनल" टैब के तहत ~ 9% ट्रांसमिशन से 15-20% ट्रांसमिशन के लिए दो फोटॉन की तीव्रता बदल जाते हैं।
- एक अक्षतंवर को तोड़ने के लिए लगभग 1 सेकंड के लिए "फास्ट एक्सवाई" बटन को सक्रिय करें और फिर अतिरिक्त क्षति से बचने के लिए स्टॉप बटन दबाएं। यदि प्रक्रिया काम की जाती है तो अक्षतंतरे को बिखरे मलबे के रूप में देखा जाना चाहिए।
- यह सुनिश्चित करने के लिए कि अक्षतंश क्षतिग्रस्त हो गया था 488 एनएम आर्गन लेजर पर वापस स्विच करें, एक और कॉन्फोकल छवि लें, और अधिकतम प्रक्षेपण बनाएं।
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