פונקציה ג'ין יכול להיות מוסתר על הפסד של פונקציה ניסויים אם קיים פיצוי על ידי גן אחר. המודל של דג הזברה מספק תפוקה גבוהה יחסית אמצעי לחשוף יתירות פונקציונלית כאלה עוברים חיים.
Abstract
פונקציה ג'ין במהלך embryogenesis מוגדר בדרך כלל על ידי אובדן של פונקציה ניסויים, למשל על ידי mutagenesis ממוקד (נוקאאוט) בתוך העכבר. במודל דג הזברה, יעיל טכניקות גנטיות הפוך פותחו באמצעות microinjection של גן ספציפי morpholinos antisense. Morpholinos יעד mRNA באמצעות זיווג בסיסים ספציפיים גן פונקציה לחסום זמנית על ידי תרגום שחבור עיכוב או במשך מספר ימים במהלך embryogenesis (מציאה). עם זאת, בעלי חוליות כמו עכבר או דג הזברה, פונקציות כמה גנים יכולים להיות מוסתר על ידי גישות אלו בשל נוכחותם של גן אחר אשר מפצה על אובדן. זה נכון במיוחד עבור משפחות גנים המכילים גנים אחותו כי הם שיתוף לידי ביטוי בפיתוח רקמות זהה. בשנת דג הזברה, פיצוי תפקודית ניתן לבדוק באופן יחסית תפוקה גבוהה, על ידי הזרקה משותף של morpholinos כי היעד מציאה של שני גנים בעת ובעונה אחת. כמו כן, באמצעות morpholinos, אינטראקציה גנטית בין כל שני גנים ניתן להדגים על ידי מציאה של גנים שניהם יחד משנה סף רמות. לדוגמה, ניתן morpholinos טיטרציה כזו לא מציאה הפרט יוצר פנוטיפ. אם, בתנאים אלה, שיתוף הזרקה של שני morpholinos גורם פנוטיפ, אינטראקציה גנטית מוצג. כאן אנו מדגימים כיצד להראות יתירות פונקציונלית בהקשר של שני גורמי תעתוק הקשורות גאטה. גורמים gata חיוניים מפרט של אבות לב, אבל זה מתגלה רק על ידי אובדן של שני Gata5 ו Gata6. אנו מראים כיצד לבצע ניסויים microinjection, לאמת את morpholinos, ולהעריך את הפנוטיפ פיצוי cardiogenesis.
Protocol
המטרה שלנו כאן היא לבחון את יתירות פונקציונלית של שני גורמי שעתוק עבור המפרט של אבות cardiomyocyte. גורמים מקודדים על ידי שני גנים הקשורים gata5 ו gata6 ואנחנו באמצעות מודל דג הזברה כדי להבין פונקציות היחסי 1. האסטרטגיה שלנו היא לחסום לתפקד הגן באמצעות morpholinos 2.<…
Discussion
בניסוי המתואר כאן, אנחנו בשילוב שני morpholinos, שכל אחד מהם לבדו ליצור מגוון של פנוטיפים שונים, ומצא פנוטיפ שונה לגמרי כשהיו שיתוף מוזרק ביחד. כמובן, אנחנו צריכים להצדיק את ביצוע הניסוי הזה מלכתחילה. חשדנו כי שני גנים יכול לפצות אחד את השני עבור פונקציה קודמת, במפרט במקרה ז…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי מעבדה אוונס על עזרתם בהכנת המצגת. Morpholinos השתמשו כאן היו תקפות במקור על ידי ד"ר אודרי Holtzinger. TE נתמך על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (HL064282 ו HL056182). ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי המכון לטיפול בבעלי חיים ועדת שימוש, של וייל קורנל מדיקל קולג'.
Rikin, A., Rosenfeld, G. E., McCartin, K., Evans, T. A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis. J. Vis. Exp. (42), e2020, doi:10.3791/2020 (2010).