Summary
Gen functie kan worden verduisterd in de verlies-van-functie experimenten als er sprake is compensatie door een ander gen. De zebravis model biedt een relatief high-throughput middel om dergelijke functionele redundantie onthullen in levende embryo's.
Abstract
Gene functie tijdens de embryogenese wordt meestal bepaald door het verlies-van-functie experimenten, bijvoorbeeld door middel van gerichte mutagenese (knock-out) in de muis. In de zebravis model, doeltreffende omgekeerde genetische technieken die zijn ontwikkeld met behulp van micro-injectie van gen-specifieke antisense morpholinos. Morpholinos doel een mRNA via specifieke base-pairing en blokkeren genfunctie tijdelijk door het remmen van vertaling of splitsen voor meerdere dagen tijdens de embryogenese (knockdown). Echter, in gewervelde dieren zoals muizen of zebravissen, kunnen sommige genfuncties worden gestoord door deze benaderingen door de aanwezigheid van een ander gen, dat compenseert het verlies. Dit geldt vooral voor gen-families met zus genen die co-uitgedrukt in dezelfde ontwikkelen van weefsels. In de zebravis, kan functionele compensatie worden getest in een relatief high-throughput wijze, door co-injectie van morpholinos die zich richten op knockdown van beide genen tegelijk. Ook met behulp van morpholinos, kan een genetische interactie tussen twee genen worden aangetoond door knockdown van beide genen samen op sub-threshold levels. Kan bijvoorbeeld morpholinos worden getitreerd zodanig dat noch individuele knockdown een fenotype genereert. Als onder deze omstandigheden, co-injectie van beide morpholinos veroorzaakt een fenotype, is een genetische interactie getoond. Hier laten we zien hoe de functionele redundantie show in het kader van twee verwante GATA transcriptiefactoren. GATA factoren zijn essentieel voor de specificatie van cardiale voorlopercellen, maar dit is alleen onthuld door het verlies van zowel Gata5 en Gata6. We laten zien hoe het uitvoeren van micro-injectie experimenten, valideren morpholinos, en evalueren van het gecompenseerde fenotype voor cardiogenese.
Protocol
Ons doel hier is om de functionele redundantie van twee transcriptiefactoren test voor de specificatie van cardiomyocyt voorouders. De factoren worden gecodeerd door de twee verwante genen gata5 en gata6 en we gebruiken de zebravis model van hun relatieve functies 1 te begrijpen. Onze strategie is het blokkeren van gen-functie met behulp van morpholinos 2. We zullen injecteren morpholinos voor de ene of de andere gen in de bevruchte eieren, en vergelijk de embryonale fenotype met embryo's van eieren gelijktijdig geïnjecteerd met beide morpholinos. Ter vereenvoudiging van de evaluatie van de fenotypes, gebruiken we eieren afkomstig van vissen die een transgen dat GFP tot uitdrukking in cardiomyocyten dragen.
Stap 1. Voorbereidingen voor micro-injectie.
A) Het opzetten van broedparen van vis
De avond voorafgaand aan de injectie, zijn een mannelijke en een vrouwelijke volwassen vissen (3-18 maanden oud) die in paren in de fokker tanks, gescheiden door een scheidingswand tot de volgende ochtend. We meestal opgezet 10-20 broedparen van de vissen, en deze worden een keer per week gekoppeld, ongeacht of de eieren worden gebruikt, om vruchtbaarheid te behouden. Voor dit experiment gebruiken we een reporter stam, transgene voor cmlc2: EGFP, omdat het een eenvoudige uitlezing te differentiëren cardiomyocyten te identificeren. De volgende morgen, nadat de lichten zijn ingeschakeld, het water is veranderd, en verdelers worden getrokken uit de tanks waardoor de vissen paren om te paren en produceren eieren. Ei-productie kan worden gecontroleerd, en kan onmiddellijk starten, of na een periode van een uur of meer, afhankelijk van de vis. Typisch, na ongeveer 20 minuten ononderbroken paring, worden de eitjes verzameld met behulp van een pipet of zeef en uitgegoten in 100 mm platen met het systeem water. Het is belangrijk om de productie van eieren te controleren om ervoor te zorgen dat embryo's worden geïnjecteerd tussen de 1-4 cellig stadium. Door het vrijgeven van meerdere paren tegelijk, is het mogelijk om de ei-productie wankelen en daardoor een maximale hoeveelheid van de eieren die kan worden geïnjecteerd in een vroeg ontwikkelingsstadium. Een goed paar vissen kunnen genereren meer dan 200 embryo's, en het heeft geen praktische zin om duizenden eieren te halen in het zelfde tijd, aangezien een enkele onderzoeker zou niet in staat zijn om ze te inject snel genoeg voor ze verder te ontwikkelen dan de 4-cellig stadium . Vissen worden gestimuleerd om broeden op het licht cyclus, dus dit is een experiment dat een vroege start nodig, en eieren worden meestal niet verkregen na de middag.
B) het opstellen naalden
- Gebruik een Micropipet Puller en een 3,5 "glazen capillaire buis met twee naalden met behulp van de volgende voorwaarde te genereren: Warmte = 626, Pull = 60, Snelheid = 60, en Tijd = 250 We maken gebruik van open kern naalden die geen een gloeidraad, omdat. we front-vul ze met afzuiging.
- Het uiteinde van elke naald wordt dan zachtjes verbroken met een schone scheermesje of forceps, en vervolgens afgeschuind op een 30 graden hoek voor ongeveer 20 seconden met behulp van een EG-4 micro-molen. Dit versterkt nog de tip en het is belangrijk als je injecteren via het chorion.
- Het is belangrijk om het verkrijgen van een consistente diameter naald tip grootte van ongeveer 15 micron (gekalibreerd 4 eenheden met behulp van een gerasterde microscoop oculair, om te kunnen een 1-2 nl injectievolume kalibreren).
- Naalden moeten worden voorbereid, veilig opgeslagen in een beveiligde locatie, en ieder is individueel vlak voor gekalibreerd het starten van injecties om consistente injectie volume te verzekeren (zie sectie D voor details). Als je het geluk, kunt u in staat om een enkele naald te gebruiken voor een hele experiment. Toch kan een naald gemakkelijk breken in het midden van een experiment, en u niet wilt dat de tijd gebruiken om nieuwe naalden te trekken.
C) Het maken van platen injectie
- Bereiding van 100 ml van een 2% agarose-oplossing in het systeem van water, door ze te koken in een magnetron.
- Koel aan, en giet ongeveer 12ml in de omgekeerde deksel van een 100mm petrischaal.
- Plaats 2 microscoopglaasjes, schuin op ongeveer 45 graden hoeken, in de twee zijden van het deksel. Nadat de agarose is gestold en zachtjes weg te trekken van de twee dia's van het deksel.
- Dit creëert troggen waar de embryo's zal worden geplaatst en vervolgens geïnjecteerd. Meerdere platen kunnen van tevoren worden voorbereid. Ze kunnen voor onbepaalde tijd worden opgeslagen bij 4 ° C na het toevoegen van een laag van 70% ethanol, het toevoegen van de onderkant van de originele plaat, en afdichten met parafilm. Vergeet niet om goed te wassen voor gebruik.
D) micro-injectie station en naald kalibratie
- Zet de samengeperste stikstof bron en PLI-100 microinjector. De injector moet worden aangepast voor een constante stroom druk van 18 PSI.
- Voordat u een naald, verzekeren dat de micromanipulator is in een juiste positie om een breed scala van beweging toe te staan, en dat een ingevoegde naald gaat niet aan de tafel. Steek een van dede naalden eerder opgesteld (zie punt C) in de micromanipulator ervoor te zorgen dat er een goede afdichting. Wees voorzichtig dat u de naald breken.
- Let op de naald onder de microscoop om te zorgen dat niet verstopt is voordat u verder gaat de kalibratie.
- Plaats een druppel (2-3 ul) van injectie-oplossing of DDH 2 O op een klein stukje van de parafilm en vult ongeveer 1,5 ui door te trekken in de naald met behulp van de knop te vullen. Zorg ervoor dat u de punt van de naald volledig in de oplossing hebben, en observeer de vloeistof zuig door de microscoop om te voorkomen dat in de tekening eventuele luchtbellen.
- Plaats een druppel van minerale olie op het rooster van een micrometer.
- Pas empirisch het moment van injectie om ervoor te zorgen dat de druppelgrootte is ongeveer 1,5 micron in diameter. Dit levert een injectievolume van ~ 1.8 nl. De werkelijke volume kan worden aangepast aan uw keuze, maar in praktische zin is het moeilijk om goed te kalibreren hoeveelheden van minder dan 1 nl, en de embryo's mogen niet tolereren volumes boven de 2 nl. Ongeacht de grootte van het volume die u kiest, houd het hetzelfde voor al uw injecties inbegrip van de controles, en pas uw oplossing concentraties (in plaats van de injectie volume) om de hoeveelheid ingespoten morfolino titreren.
- Herijking nodig is elke keer een naald wordt vervangen, omdat de naald grootte variëren.
Stap 2. Validatie van morpholinos gericht op twee verschillende genen
Morpholinos zijn ontworpen om de translatie-initiatie site of splice sites van een doel-mRNA waardoor het blokkeren van de eiwitsynthese of de juiste mRNA verwerking doel. Bij het analyseren van een gen voor de eerste keer maken we gebruik van beide typen morpholinos om te testen of ze genereren hetzelfde fenotype, hetgeen wijst op een specifiek knockdown. Een voordeel van de splice-blocker is dat je kunt controleren of de knockdown van de normale transcript door RT-PCR, dat is vooral handig als antilichamen voor de target-gen zijn niet beschikbaar. We zullen zien hoe een consistent cardiaal fenotype is bereikt voor de gata5 en gata6 genen met behulp van morpholinos (gata5 5'UTR MO sequentie: 5'-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3 '; gata5 Splice Site MO sequentie: 5'-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3'; gata6 5 'UTR MO sequentie: 5'-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3').
- Morpholinos worden verkregen van Gene Tools, LLC (Philomath, OR). Gene Tools zal u helpen kiezen voor de beste volgorde te richten, als je hun ondersteunend personeel te vragen. U hoeft alleen maar te sturen met de toetreding nummer, en zij zullen adviseren. Er is echter geen garantie dat de morfolino zal werken, dat is de reden waarom je moet bereid zijn om de activiteit te valideren. U kunt ook controleren of de morfolino is verkrijgbaar bij OpenBiosystems. Gene Tools biedt voorraden gesynthetiseerd morpholinos aan OpenBiosystems. Hoewel er is weer geen garantie dat het zal werken, ze verkopen kleinere hoeveelheden tegen een lagere kostprijs, wat kan dekken de kosten hulp voor het testen van nieuwe doelen. Zorg dat u uw morfolino BLAST tegen het transcriptoom, gebruiken we de BLAT-functie op de UCSC zebravis genoom browser (genome.ucsc.edu). Natuurlijk, als een morfolino is gevalideerd (streng) in de literatuur, is het aanbevolen dat u dat dezelfde sequentie aan te schaffen.
- De morfolino wordt opgelost in steriel DDH 2 0 tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM en bij kamertemperatuur bewaard. NIET FREEZE de morfolino oplossingen, als om wat voor reden lage temperaturen kan soms veroorzaken ze te aggregeren en de neerslag. Morpholinos zijn ongevoelig voor proteasen of nucleasen, dus zolang het water dat je toevoegt steriel is, moeten ze wel veilig zijn bij kamertemperatuur.
- Alvorens te injecteren, incubeer de morfolino bij 65 ° C gedurende 5 minuten om dit te verzekeren is het volledig is opgelost en laat afkoelen tot kamertemperatuur. Plaats de steekproef op het ijs. Houd de morfolino bij kamertemperatuur totdat injectie.
- Te titreren een morfolino, we meestal voor te bereiden seriële verdunningen van de voorraad concentratie in DDH 2 0 aan het werken concentraties van 1 mM opbrengst, 0,5 mM, 0,25 mM, en 0,125 mm. Afhankelijk van de volgorde, met behulp van 1,8 nl van de injectie volume, dit vertegenwoordigt ongeveer 20ng, 10ng, 5ng en 2.5ng van morfolino per injectie. Dit is slechts een uitgangspunt, omdat de tolerantie en werkzaamheid van elk morfolino variëren zal en kan niet worden voorspeld. De meeste morpholinos zal niet worden getolereerd veel boven de 20 ng, maar sommige effectief kan zijn in doses die veel lager dan 1 ng. Onze aanpak is het definiëren van de concentratie waarbij een fenotype "plateaus". Met andere woorden, als een bepaald fenotype wordt niet gezien met behulp van 2,5 ng, maar is vergelijkbaar met elk bedrag op of boven 5 ng, zouden we kiezen voor 5 ng als een drempelbedrag. Natuurlijk kan het handig zijn om volgende titreren tussen de 2,5 en 5,0 ng ng, om ervoor te zorgen dat u werkt reproduceerbaar boven de drempel, in plaats van rechts "op de grens".
- Vul de bijgevoegde en gekalibreerd naald(Zie boven) met de laagste concentratie te werken (de meeste verdund) morfolino oplossing. Voorkomen dat over-het vullen van de naald, want het zal alleen maar afval. Als u vult slechts 1 pl is er voldoende oplossing voor de 500 injecties.
- Met behulp van een disposable pipet bevruchte een-cel embryo's in de bakken van de micro-injectie plaat. Verwijder overtollig water om ervoor te zorgen dat de embryo's vallen op de bodem van de injectie dalen. Ze moeten niet drijven, maar houden aan de agarose bed.
- Plaats de injectie plaat, zodat de micromanipulator kan de naald door het chorion en in de dooier voor injectie dalen. Naar positie individuele embryo's, te manipuleren de injectie plaat zodanig dat de punt van de injectienaald duwt of trekt de embryo's naar de juiste positie. Wees voorzichtig dat u de naald of de schade embryo's breken! Dit kost enige oefening, maar als een regel die u gebruik maken van de micromanipulator gewoon om de injectienaald te verplaatsen naar het embryo en vervolgens na de injectie, in plaats van snel en zuiver uit. Embryo's worden gebracht injectie plaats door het bewegen van de plaat met uw vrije hand (linkerhand als u deze te injecteren met uw rechterhand). Voor een nieuwe leerling, is het nuttig om te oefenen met behulp van een oplossing van 0,25% fenol rood om de geïnjecteerde oplossing te visualiseren. Het vertrouwen wordt ook verkregen door het injecteren van een oplossing die fluorescent-gelabelde microsferen (Molecular Probes, F-8794), om die oplossing te bevestigen werd geïnjecteerd in het embryo, in plaats van de inter-chorion ruimte. Echter, na een paar rondes van de praktijk worden deze hulpmiddelen vaak niet meer nodig. Het is een goed idee om zo nu en dan injecteren in de lucht, alleen maar om te bevestigen dat de naald niet verstopt is en dat het volume wordt ingespoten lijkt het passend.
- Geïnjecteerde embryo's worden terug overgebracht naar een 100mm petrischaal met systeem-water-en gekweekt bij 28.5C. Na de injectie van de laagste concentratie te werken, kan elke resterende oplossing worden uitgezet en de volgende hoogste concentratie van het werk morfolino gebruikt om de naald te vullen. Herhaal dit voor elke concentratie van morfolino. Hoewel het mogelijk is te spoelen van de naald met behulp van water, bij het testen van een duidelijke morfolino, geven we de voorkeur aan naalden te veranderen en te herijken. Zorg ervoor dat u een cohort van uninjected embryo's na te gaan of de specifieke partij van embryo's was gezond en normaal te houden.
Stap 3. Co-injectie van morpholinos op individuele drempel doses
Het doel van de titratie van de hierboven werd een drempel dosis vast te stellen voor elke morfolino. In het beste geval, zal in hoofdzaak 100% van de morphants scherm een bepaald fenotype, als de beoogde gen heeft een essentiële functie. U kunt echter rekenen op enige variabiliteit te wijten aan verkeerde injectie artefacten. Met de praktijk zou dit niet meer dan 10%. Sommige batches van embryo's (inclusief de uninjected controles) kan niet goed overleven, in welk geval het experiment moet mogelijk worden verdisconteerd. Ondertussen is er ook biologische variabiliteit, aangezien individuele embryo's mogen worden meer of minder tolerant naar de knockdown. Tot slot kunnen sommige morpholinos gewoon niet efficiënt genoeg zijn om een robuuste (penetrant) knockdown te bereiken. Als een fenotype wordt opgewekt in een laag percentage van embryo's, maar het is reproduceerbaar, kan het de moeite waard het testen van een duidelijke morfolino. Het doel van deze volgende experiment is om te bepalen of een geheel nieuwe fenotype wordt gezien als beide genen tegelijkertijd gericht. Wij zijn niet gewoon op zoek naar een verhoging van het percentage van embryo's die een morphant fenotype hebben, maar eerder voor het genereren van een afzonderlijke fenotype dat niet gezien op of boven de drempel bij het testen van een van de afzonderlijke genen.
- Maak een mengsel van de combinatie van morpholinos eerder geteste, op de drempel concentratie van elke individuele morfolino dat een bepaald fenotype gegenereerd. Bijvoorbeeld, als de drempel voor elk gen was 5 ng, bereiden een werkende oplossing die 5 ng + 5 ng van elke (10 ng totaal) zal bevatten. Omdat embryo's mogen niet tolereren veel meer dan 20 ng totaal morfolino, is het belangrijk, gebaseerd op de vorige experimenten, het gebruik van de minimale hoeveelheid van elk die voldoende is om efficiënt te richten elk gen.
- Controles dienen te bestaan sets van embryo geïnjecteerd met elke individuele morfolino alleen aan dezelfde concentratie die werd gebruikt voor de combinatie. De volumes van injectie oplossing moet constant worden gehouden (bijv. 1.8 nl). Een groot voordeel van het gebruik van een verslaggever stam is dat je het fenotype (bijvoorbeeld cardiomyocyten differentiatie) te evalueren op elk gewenst moment, herhaaldelijk en. Als embryo's moeten worden geëvalueerd voor genexpressie door in situ hybridisatie, kunnen stage-gematchte embryo's en controles worden vastgesteld op verschillende tijdstippen na de injectie. Voor ons experiment, gaan we GFP expressie evalueren als een surrogaat voor cardiomyocyten differentiatie, op ongeveer 24 hpf.
Stap 4. Ewaardering van de fenotypes
- Geïnjecteerde embryo's moet worden gecontroleerd, net na de injectie, en meerdere keren gedurende de dag, aan een dode of stervende embryo's te verwijderen, omdat deze de levensvatbaarheid van de resterende morphants compromis. Voor het evalueren van de expressie van het reporter-gen, worden embryo's onderzocht met behulp van een dissectiemicroscoop uitgerust met fluorescentie capaciteit. We maken gebruik van een Nikon SMZ1500 microscoop, met een 1x of 1,6 x doelstelling en een bereik van vergrotingsfactor van 0,75 x tot 11.25x. Bij gebruik van een TL-filter, moet u het diafragma open voor het volledig open instelling om de lichtintensiteit te maximaliseren. Ook voor zorgen dat het juiste filter te gebruiken, afhankelijk van het reporter-gen (GFP, RFP, etc.).
- Embryo's zijn meestal verdoofd met behulp van een 1 / 20 verdunning in het systeem water van 4mg/ml voorraad tricaïne methaansulfonaat. De voorraden worden opgeslagen bevroren bij-20C. Als alternatief kunnen embryo's worden gedood met behulp van de 20x tricaïne voorraad. Embryo's kunnen meestal worden gescreend, zelfs als ze nog in het chorion. Echter, vooral als ze worden gefotografeerd, het is een goed idee om de chorions met behulp van scherpe pincet te verwijderen. Embryo's kunnen worden bekeken na het plaatsen bij depressie dia's in de tricaïne oplossing, of beter te immobiliseren voor fotografie geplaatst in een kleine daling van 3% methylcellulose.
- Let op embryo fenotypes in die geïnjecteerd met de combinatie van morpholinos in vergelijking met enkele morphants. Hier zijn we op zoek naar het patroon van GFP expressie in de oorspronkelijke hart buis. In deze verslaggever stam GFP is uitsluitend uitgedrukt in cardiomyocyten via de cmlc2 promotor, die een gedetailleerde analyse van cardiale specificatie en hart buis morfogenese mogelijk maakt.
Representatieve resultaten
In ons experiment, zowel de gata5 en gata6 single morphants tonen reproduceerbare cardiale fenotypes bij geïnjecteerd met drempels, maar er is veel biologische variabiliteit 3,4. Bijvoorbeeld, de meeste van de gata5 morphants genereren van een gespleten hart, met GFP expressie in twee regio's. Dit gebeurt omdat de cardiale voorlopercellen niet te migreren goed aan bij de middenlijn zekering tijdens het hart buis formatie. Echter, sommige van de gata5 morphants doen het genereren van een defecte hart buis, en in een klein aantal (5%) is er een significante daling in het aantal GFP + cellen. We geloven dat dit weerspiegelt biologische variabiliteit, maar kan ook te wijten zijn aan het feit dat de morpholinos niet gelijkwaardig zijn aan een "null" mutatie.
Ook de gata6 morphants alle tonen een cardiale fenotype, maar er is een reeks van fenotypen, waaronder een klein aantal gespleten verwarmt, en harten die morfologische verstoord in vergelijking met de uninjected controle-embryo's. Deze variabiliteit is niet ongebruikelijk voor een cardiale morfogenetische fenotype, want hart-vorming is een dynamisch proces en ten minste een deel van het hart fenotype kan indirect het gevolg zijn van uit embryonale morfogenetisch gebreken. Echter, belangrijker nog, het bereik van de cardiale morfogenetische gebreken voor zowel gata5 en gata6 morphants is consistent en reproduceerbaar, en voor het grootste deel van de embryo's aanzienlijke GFP + cardiomyocyten.
In schril contrast met de gata5 en gata6 single morphants, embryo's uitgeput van beide factoren blijkt een volledig verlies van GFP expressie, in overeenstemming met een verlies van hartspiercellen. Zo gata5 en gata6 elk een niet-redundante functies voor cardiale morfogenese, maar de twee genen functioneel redundant in een eis voor het genereren van gedifferentieerde cardiomyocyten. Onze vorige studies toonden ook een verlies van de eerste cardiomyocyt markers, waaronder nkx2.5, suggereert een vereiste voor cardiomyocyten specificaties 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In het experiment hier beschreven, combineerden we twee morpholinos, die elk alleen al het genereren van een duidelijke reeks van fenotypen, en vond een heel ander fenotype toen ze samen waren co-injectie. Uiteraard moesten we een rechtvaardiging voor het doen van dit experiment in de eerste plaats. We vermoedden dat de twee genen kunnen elkaar compenseren voor een eerdere functie, in dit geval hart-specificatie. Dit komt omdat de genen zijn zeer verwant (en in staat te binden aan dezelfde DNA-sequenties) en worden uitgedrukt in overlappende patronen tijdens de embryogenese 5. Bovendien, genetische experimenten in Drosophila aangegeven dat GATA transcriptiefactoren moeten worden verplicht voor cardiale specificatie 6.
Maar er zijn ook andere situaties die deze strategie kunnen worden gebruikt voor het testen van functionele redundantie of meer in het algemeen voor genetische interacties. Ten eerste kan knockdown van een of beide genen genereert geen voor de hand liggende fenotype. In dit geval is er geen drempelwaarde gedefinieerd voor elk gen, en de hoeveelheid morfolino-gebruik zal empirisch worden bepaald, beperkt door hoe goed ze worden getolereerd door de embryo's. Nogmaals, de reden voor het testen van schadevergoeding waarschijnlijk dat de genen zeer verwant zijn en uit te bevestigen co-expressie patronen. Ten tweede, genetische interacties kan getest worden voor elk genenpaar met behulp van sub-drempel hoeveelheden morpholinos. In deze strategie, is de maximale bedrag dat niet het genereren van een fenotype gebruikt voor elke morfolino. Als combinatie van beide morpholinos genereert een fenotype, levert dit een sterk bewijs voor een genetische interactie, maar het kan heel indirect of zelfs vertegenwoordigen parallelle paden. Ten derde, co-injectie van een seconde morfolino kan redden het fenotype van de eerste, als de twee genen interageren in een antagonistische manier (die opnieuw kunnen worden indirect). Hoewel er geen bepaald limiet aan hoeveel verschillende genen kunnen worden gericht, in praktische zin is het waarschijnlijk 3-4 genen, afhankelijk van het bedrag van elke morfolino dat nodig is voor een drempel reactie.
Hoewel deze algemene aanpak van het gebruik van reverse genetics om nieuwe genfuncties onthullen is relatief high-throughput, zijn er een aantal kanttekeningen te overwegen ten aanzien van morpholinos. Voor het combineren van morpholinos, is een aanzienlijke inspanning nodig is om de individuele reagentia te valideren, indien dit nog niet is bereikt. Een enkele morfolino kunnen mogelijk niet werken, terwijl anderen kan genereren off-targeting 'artefact' fenotypen in het bijzonder in verband met de activering van wijdverspreide apoptose. De reagentia zijn niet goedkoop, en als er twee of meer morpholinos nodig zijn om elk gen te valideren, deze investering kan aanzienlijk zijn.
Verschillende overwegingen kunnen begeleiden de experimentele strategie.
i) Is er een bekende mutant fenotype? Als dat zo is, moet een feno-kopiëren morfolino voldoende.
ii) is er een antilichaam beschikbaar? Als dat zo is, kan een vertaling-blokker de voorkeur, en zo niet, is het van belang aan te tonen dat een splice-blocker effectief de pre-mRNA doelstellingen.
iii) Kunt u het morphant redden door de injectie van mRNA? Als dit werkt, biedt het uitstekende bewijs voor morfolino specificiteit. Het kan echter vaak niet werken, als gevolg van verkeerd richten van de geïnjecteerde mRNA. Rescue kan ook worden getest met behulp van transposon-op basis van transgenese, omdat dit kan strengere ruimtelijke en tijdelijke controle over de expressie van de beoogde gen mogelijk te maken. In beide gevallen is het belangrijk ervoor te zorgen dat de redding gen niet is gericht door de morfolino.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken de leden van de Evans laboratorium voor hun hulp bij de voorbereiding van deze presentatie. De morpholinos hier gebruikt werden oorspronkelijk gevalideerd door dr. Audrey Holtzinger. TE wordt ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (HL064282 en HL056182). Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door het Institute for Animal Care en gebruik Comite dat is ingesteld, van het Weill Cornell Medical College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | ||
| Fish nets | Aquatic Habitats | ||
| System water | 60mg Instant Ocean” per liter dH2O | ||
| 100mm Petri dishes | BD Biosciences | 351029 | |
| Micropipette needle puller | Sutter Instrument Co. | P-97 Flaming/Brown | |
| 3.5" glass capillaries | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Razor blade | Personna Medical Care | 94-120-71 | |
| Micro grinder | Narishige International | EG-4 | |
| Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | |
| Micrometer | WARD’s Natural Science | 94 W 9910 | |
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | |
| Disposable weigh dishes | Fisher Scientific | 2-202-B | |
| Conventional microwave | GE Healthcare | ||
| Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552 | |
| Graduated cylinder | Fisher Scientific | 08-572-6D | |
| Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | |
| 70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | |
| N2 tank | Tech Air | ||
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | |
| Dissecting microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Parafilm | American National Can | PM-992 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5’-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3’ | |
| gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5’-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3’ | |
| gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5’-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3’ | |
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Tricaine Methanesulfonate | Argent Labs | MS-222 | |
| Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | |
| Heat Block | Fisher Scientific | 11-718-4 | |
| Sharp forceps | Dumont | Size 55 | |
| Depression Microslides | VWR international | 48339-009 |
References
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. Dev Biol. 312, 613-622 (2007).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Dev Biol. 311, 623-635 (2007).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata4 regulates the formation of multiple organs. Development. 132, 4005-4014 (2005).
- Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. GATA factors in Drosophila heart and blood cell development. Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).
