Un approccio inverso di test genetici per ridondanza funzionale durante l'embriogenesi

Summary

La funzione del gene può essere oscurato la perdita di funzione esperimenti se non vi è compensazione da un altro gene. Il modello di zebrafish fornisce un numero relativamente elevato throughput significa rivelare tale ridondanza funzionale negli embrioni viventi.

Abstract

La funzione del gene durante l'embriogenesi è tipicamente definito da perdita di funzione di esperimenti, per esempio mutagenesi mirata (eliminazione diretta) nel topo. Nel modello di zebrafish, efficaci tecniche della genetica inversa sono stati sviluppati utilizzando microiniezione di geni specifici per Morpholinos antisenso. Morpholinos un mRNA bersaglio attraverso specifici di base-accoppiamento e funzione genica bloccare transitoriamente dalla traduzione inibendo o splicing per diversi giorni durante l'embriogenesi (atterramento). Tuttavia, nei vertebrati come mouse o pesce zebra, alcune funzioni geniche possono essere oscurate da questi approcci per la presenza di un altro gene che compensa la perdita. Ciò è particolarmente vero per le famiglie di geni contenenti geni sorella che sono co-espressi nei tessuti stesso sviluppo. In zebrafish, compenso funzionale può essere testato in maniera relativamente elevato throughput, per co-iniezione di Morpholinos che knockdown obiettivo di entrambi i geni contemporaneamente. Allo stesso modo, usando Morpholinos, una interazione genetica tra due geni può essere dimostrato con atterramento di entrambi i geni insieme a livello sub-livelli di soglia. Per esempio, Morpholinos può essere titolata in modo tale che né i singoli knockdown genera un fenotipo. Se, in queste condizioni, co-iniezione di entrambi Morpholinos causa un fenotipo, una interazione genetica è mostrato. Qui mostriamo come mostrare ridondanza funzionale nel contesto di due fattori correlati trascrizione GATA. Fattori GATA sono essenziali per la specificazione dei progenitori cardiaco, ma questo si rivela solo dalla perdita di entrambi i Gata5 e Gata6. Mostriamo come svolgere esperimenti microiniezione, convalidare il Morpholinos, e valutare il fenotipo compensato cardiogenesis.

Protocol

Il nostro obiettivo è quello di testare la ridondanza funzionale di due fattori di trascrizione per la specificazione dei progenitori dei cardiomiociti. I fattori sono codificate da due geni correlati gata5 e gata6 e stiamo utilizzando il modello zebrafish per capire le loro relative funzioni ^1. La nostra strategia è bloccare la funzione del gene utilizzando Morpholinos ^2. Noi inietterà Morpholinos per l'uno o l'altro gene in uova fecondate, e confrontare il fenotipo embrionale con embrioni derivati ​​da uova iniettate contemporaneamente con entrambi i Morpholinos. Per semplificare la valutazione dei fenotipi, usiamo le uova ottenuti da pesci che portano un transgene che esprime GFP in cardiomiociti.

Fase 1. Preparazione per la microiniezione.

A) Impostazione di coppie nidificanti di pesce

La sera prima dell'iniezione, singoli pesci di sesso maschile e singolo femminile adulta (3-18 mesi di età) sono disposti a coppie in serbatoi allevatore separati da un divisorio fino al mattino successivo. Noi di solito impostato 10-20 coppie di pesci, e questi sono abbinati una volta a settimana, indipendentemente dal fatto che le uova saranno utilizzati, per mantenere la fecondità. Per questo esperimento che stiamo usando un ceppo reporter, transgenici per cmlc2: EGFP, perché fornisce una lettura semplice per identificare i cardiomiociti differenziazione. La mattina dopo, una volta che le luci sono accese, l'acqua è cambiato, e divisori sono tirati da carri armati che permette le coppie di pesce per accoppiarsi e produrre le uova. Produzione di uova possono essere monitorati, e possono avviare immediatamente, o dopo un periodo di un'ora o più, a seconda del pesce. In genere, dopo circa 20 minuti ininterrotti di accoppiamento, le uova vengono raccolte con una pipetta o colino e versato in 100 piatti millimetri Petri contenente acqua di sistema. E 'importante monitorare la produzione di uova in modo da garantire che gli embrioni vengono iniettate tra la fase di 1-4 cellule. Attraverso il rilascio di diverse paia alla volta, è possibile scaglionare la produzione di uova e quindi massimizzare la quantità di uova che può essere iniettato in una fase iniziale di sviluppo. Un buon paio di pesce può generare più di 200 gli embrioni, e non ha alcun senso pratico per raccogliere migliaia di uova al tempo stesso, dal momento che un investigator unico non sarebbe in grado di iniettare loro abbastanza in fretta prima che si sviluppano oltre il 4 celle stadio . I pesci sono stimolate ad allevare il ciclo di luce, quindi questo è un esperimento che richiede un rapido avvio, e le uova non sono di solito ottenuti dopo mezzogiorno.

B) Preparazione aghi

1. Utilizzare un estrattore Micropipetta e da 3,5 "tubo capillare di vetro di generare due aghi utilizzando la seguente condizione: calore = 626, Pull = 60, Velocità = 60, e Tempo = 250 Noi utilizziamo aghi nucleo aperto che non contengono un filamento, perché. li abbiamo front-fill con aspirazione.
2. La punta di ciascun ago viene poi delicatamente rotto con una lama di rasoio pulito o pinze e, successivamente, smussato in un angolo di 30 gradi per circa 20 secondi utilizzando un EG-4 micro-grinder. Ciò acuisce la punta ed è importante se si inietta attraverso il corion.
3. E 'importante ottenere un consistente Diametro punta dell'ago di circa 15 micron (tarato con 4 unità utilizzando un oculare con reticolo microscopio, per poter calibrare un volume di iniezione 1-2 nl).
4. Gli aghi devono essere preparati in anticipo, immagazzinata in modo sicuro in un luogo sicuro, e ciascuno è calibrato singolarmente appena prima di iniziare le iniezioni di assicurare costante del volume di iniezione (vedere la sezione D per i dettagli). Se siete fortunati, potreste essere in grado di utilizzare un solo ago per un esperimento intero. Tuttavia, un ago può facilmente rompere nel bel mezzo di un esperimento, e non si vuole usare questo tempo per tirare nuovi aghi.

C) Esecuzione di piastre di iniezione

1. Preparare 100 ml di una soluzione al 2% di agarosio in acqua del sistema, facendo bollire in un forno a microonde.
2. Fresco al tatto, e versare circa 12 ml nel coperchio rovesciato di un piatto 100 millimetri Petri.
3. Inserire 2 vetrini da microscopio, inclinato a circa 45 gradi, nei due lati del coperchio. Una volta che l'agarosio si è solidificato, estrarre delicatamente i due scivoli via dal coperchio.
4. Questo crea depressioni in cui gli embrioni verranno inseriti e successivamente iniettato. Piastre multiple possono essere preparati in anticipo. Essi possono essere conservati a tempo indeterminato a 4 ° C dopo l'aggiunta di uno strato di etanolo al 70%, aggiungendo il fondo del piatto originale, e tenuta con parafilm. Ricordati di lavare bene prima dell'uso.

D) Stazione Microiniezione e calibrazione ago

1. Accendere la fonte di azoto compressi e PLI-100 microinjector. L'iniettore deve essere regolato ad una pressione costante flusso di 18 PSI.
2. Prima di inserire un ago, assicurare che il micromanipolatore si trova in una posizione adeguata per consentire una vasta gamma di movimenti, e che un ago inserito non colpirà il tavolo. Inserisci uno deigli aghi preparato precedentemente (vedere la sezione C) nel micromanipolatore fare che ci sia una tenuta ermetica. Fare attenzione a non rompere l'ago.
3. Osservare la punta dell'ago al microscopio per verificare che non sia intasato prima di procedere alla calibrazione.
4. Mettere una goccia (2-3 mL) di soluzione iniettabile o DDH ₂ O su un piccolo pezzo di parafilm e riempire circa 1,5 microlitri tirando in l'ago con il pulsante di riempimento. Siate sicuri di avere la punta dell'ago completamente nella soluzione, e osservare l'aspirazione di liquido attraverso il microscopio per evitare disegno in eventuali bolle d'aria.
5. Mettere una goccia di olio minerale sulla griglia di un micrometro.
6. Empiricamente regolare il tempo di iniezione per assicurare che la dimensione calo è di circa 1,5 micron di diametro. Ciò fornirà un volume di iniezione di circa 1,8 nl. Il volume effettivo può essere regolata per la vostra scelta, ma in un senso pratico è difficile calibrare con precisione volumi inferiori a 1 nl, e gli embrioni non possono tollerare volumi superiori a 2 nl. Indipendentemente dalle dimensioni del volume scelto, mantenere lo stesso per tutte le iniezioni compresi i controlli, e modificare le concentrazioni di soluzione (piuttosto che il volume di iniezione) per titolare la quantità di iniettato morfolino.
7. La ricalibrazione è necessaria ogni volta che viene sostituito un ago, dal momento che le dimensioni la punta dell'ago può variare.

Fase 2. Validazione dei Morpholinos targeting due geni distinti

Morpholinos sono progettate per colpire il sito di inizio traduzione o siti di splicing di mRNA bersaglio bloccando così la sintesi proteica o la trasformazione mRNA corretta. Quando si analizza un gene per la prima volta, utilizziamo entrambi i tipi di Morpholinos per verificare se generano lo stesso fenotipo, indicando un atterramento specifico. Un vantaggio della giunzione-bloccante è che si può verificare l'atterramento della trascrizione normale mediante RT-PCR, che è particolarmente utile se gli anticorpi per il gene bersaglio non sono disponibili. Ci illustrerà come un fenotipo consistente cardiaca si ottiene per la gata5 e gata6 geni utilizzando Morpholinos (gata5 5'UTR sequenza MO: 5'-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3 '; gata5 sito sequenza Splice MO: 5'-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3'; gata6 5 'UTR MO sequenza: 5'-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3').

1. Morpholinos sono ottenuti da Gene Strumenti, LLC (Philomath, OR). Strumenti gene vi aiuterà a scegliere la migliore sequenza di target, se si chiede il loro personale di supporto. Hai solo bisogno di inviare loro il numero di adesione, e si consiglierà. Tuttavia, non vi è alcuna garanzia che il morfolino funziona, ecco perché bisogna essere pronti a convalidare l'attività. È anche possibile controllare se il morfolino è disponibile presso OpenBiosystems. Strumenti gene fornisce scorte di Morpholinos sintetizzato a OpenBiosystems. Mentre non vi è ancora alcuna garanzia che funzionerà, vendono quantità minori a un costo inferiore, che può contribuire a coprire i costi per testare nuovi obiettivi. Assicurati di saltare il vostro morfolino contro il trascrittoma, usiamo la funzione BLAT sul browser UCSC pesce zebra genoma (genome.ucsc.edu). Naturalmente, se un morfolino è stata convalidata (rigorosamente), in letteratura, si consiglia di acquistare quella stessa sequenza.
2. Il morfolino è sciolto in sterili DDH ₂ 0 ad una concentrazione finale di 1 mM e conservato a temperatura ambiente. Non congelare il morfolino soluzioni, come per qualche ragione le basse temperature possono talvolta causare per aggregare e precipitare. Morpholinos sono insensibili alle proteasi e nucleasi, così fino a quando l'acqua si aggiunge è sterile, che dovrebbe essere abbastanza sicura a temperatura ambiente.
3. Prima di iniettare, incubare il morfolino a 65 ° C per 5 minuti per assicurare che è completamente sciolto e lasciare raffreddare a temperatura ambiente. NON collocare il campione sul ghiaccio. Tenere il morfolino a temperatura ambiente fino ad iniezione.
4. Per titolare uno morfolino, di solito preparare diluizioni seriali della concentrazione stock in DDH ₂ 0 a produrre concentrazioni di lavoro di 1 mm, 0,5 mm, 0,25 mm e 0.125mm. A seconda della sequenza, con 1,8 nl del volume di iniezione, questo rappresenta circa 20ng, 10ng, 5ng e 2.5ng di morfolino per iniezione. Questo è solo un punto di partenza, dal momento che la tolleranza e l'efficacia di ogni morfolino varia e non può essere previsto. La maggior parte Morpholinos non sarà tollerato molto superiore a 20 ng, ma alcuni possono essere efficaci a dosi ben inferiori a 1 ng. Il nostro approccio è quello di definire la concentrazione alla quale un fenotipo "plateau". In altre parole, se un fenotipo definito non è visto di 2,5 ng, ma è simile usando qualsiasi importo pari o superiore a 5 ng, sceglieremmo 5 ng come una soglia. Naturalmente, potrebbe essere utile per titolare prossimo tra 2,5 e 5,0 ng ng, per garantire che si sta lavorando riproducibile al di là della soglia, piuttosto che a destra "sul confine".
5. Riempire l'ago e calibrato(Vedi sopra) con la più bassa concentrazione di lavoro (la maggior parte diluita) soluzione morfolino. Evitare di riempire l'ago, in quanto solo gli sprechi di materiale. Se si riempie solo 1 ml, non vi è soluzione sufficiente per 500 iniezioni.
6. Usando una pipetta usa e getta, il trasferimento fecondato unicellulare embrioni in depressioni della piastra microiniezione. Eliminare l'acqua in eccesso per garantire che gli embrioni cadono sul fondo della depressioni iniezione. Essi non devono galleggiare, ma aderire al letto di agarosio.
7. Posizionare la piastra di iniezione, in modo che il micromanipolatore può scendere la punta dell'ago attraverso il corion e nel tuorlo per l'iniezione. Per posizionare i singoli embrioni, manipolare il piatto di iniezione in modo tale che la punta di un ago per l'iniezione spinge o tira gli embrioni alla posizione corretta. Fare attenzione a non rompere la punta dell'ago o degli embrioni danni! Questo richiede una certa pratica, ma di regola si usa il micromanipolatore semplicemente per spostare l'ago per l'iniezione in embrione e poi, dopo l'iniezione, piuttosto rapidamente e in modo pulito. Gli embrioni vengono portati in posizione di iniezione spostando il piatto con la mano libera (a sinistra se si inietta con la mano destra). Per uno studente nuovo, è utile allenarsi utilizzando una soluzione contenente 0,25% rosso fenolo per visualizzare la soluzione iniettata. La fiducia è anche ottenuto iniettando una soluzione contenente microsfere fluorescenti-tag (Molecular Probes, F-8794), per confermare che la soluzione è stata iniettata l'embrione, piuttosto che l'inter-corion spazio. Tuttavia, dopo un paio di giri di pratica, questi aiuti sono tipicamente non sono più necessari. E 'una buona idea di iniettare occasionalmente in aria, giusto per confermare che l'ago non sia intasato e che il volume viene iniettato opportuno.
8. Embrioni iniettati vengono trasferiti di nuovo ad un piatto di Petri con 100 millimetri d'acqua del sistema e colto a 28.5C. Dopo l'iniezione della concentrazione più bassa di lavoro, qualsiasi soluzione rimanenti possono essere espulsi e la successiva più alta concentrazione di lavoro di morfolino utilizzati per riempire l'ago. Ripetere per ogni concentrazione di morfolino. Anche se è possibile lavare l'acqua utilizzando l'ago, quando si verifica un netto morfolino, preferiamo cambiare aghi e ricalibrare. Assicurarsi di mantenere una coorte di embrioni uninjected per verificare se il lotto specifico di embrioni era sano e normale.

Fase 3. Co-iniezione di Morpholinos a dosi soglia individuale

L'obiettivo della titolazione effettuato sopra è stato quello di definire una dose soglia per ogni morfolino. Nel migliore dei casi, praticamente del 100% del morphants mostrerà un fenotipo definito, se il gene bersaglio ha una funzione essenziale. Tuttavia, ci si può aspettare una certa variabilità a causa di errori di iniezione artefatti. Con la pratica, questo non dovrebbe superare il 10%. Alcune partite di embrioni (inclusi i controlli uninjected) non possono sopravvivere bene, nel qual caso l'esperimento potrebbe essere necessario essere scontato. Nel frattempo, c'è anche la variabilità biologica, in quanto gli embrioni individuo può essere più o meno tolleranti al knockdown. Infine, alcuni Morpholinos possono non solo essere abbastanza efficiente per ottenere un robusto (con liquidi penetranti) knockdown. Se il fenotipo è generato in una bassa percentuale di embrioni, ma è riproducibile, può valere la pena testare un distinto morfolino. L'obiettivo di questo esperimento successivo è quello di determinare se un fenotipo del tutto nuovo si vede quando entrambi i geni sono mirati simultaneamente. Noi non siamo semplicemente alla ricerca di un aumento della percentuale di embrioni che hanno un fenotipo morphant, ma piuttosto per la generazione di un fenotipo distinto che non si vede pari o superiore al livello di soglia quando si verifica uno dei singoli geni.

1. Preparare una miscela di combinazione di Morpholinos testati in precedenza, alla concentrazione soglia di ogni morfolino individuo che ha generato un fenotipo definito. Per esempio, se la soglia per ogni gene è stato di 5 ng, preparare una soluzione di lavoro che conterrà 5 ng + 5 ng di ciascuna (10 in totale ng). Dal momento che gli embrioni non possono tollerare molto di più di 20 ng totale morfolino, è importante che, sulla base dei precedenti esperimenti, di utilizzare la quantità minima di ciascuno che è sufficiente per indirizzare in modo efficiente ogni gene.
2. I controlli devono comprendere gruppi di embrioni iniettati con ogni individuo morfolino solo alla stessa concentrazione che è stato utilizzato per la combinazione. Volumi di soluzione iniettabile deve essere mantenuta costante (ad esempio 1,8 nl). Un grande vantaggio di utilizzare un ceppo giornalista è che si può valutare il fenotipo (ad esempio, differenziazione dei cardiomiociti) in qualsiasi momento, e ripetutamente. Se gli embrioni devono essere valutati per l'espressione genica di ibridazione in situ, la fase-abbinato embrioni e controlli possono essere fissate in vari momenti dopo l'iniezione. Per il nostro esperimento, abbiamo intenzione di valutare l'espressione della GFP come surrogato per la differenziazione dei cardiomiociti, a circa 24 HPF.

Fase 4. Evalutazione dei fenotipi

1. Embrioni iniettati devono essere monitorati, subito dopo l'iniezione, e più volte durante il giorno, di rimuovere qualsiasi embrione è morto o morente, in quanto questi possono compromettere la vitalità del morphants rimanenti. Per valutare l'espressione del gene reporter, gli embrioni vengono esaminati utilizzando un microscopio da dissezione dotato di capacità di fluorescenza. Usiamo un microscopio Nikon SMZ1500, con un obiettivo 1X o 1,6 x e una serie di ingrandimento da 0,75 x a 11.25x. Quando si utilizza un filtro a fluorescenza, assicurarsi di aprire il diaframma per l'impostazione completamente aperto per massimizzare l'intensità della luce. Anche essere sicuri di usare il filtro corretto, a seconda del gene reporter (GFP, RFP, ecc.)
2. Gli embrioni sono generalmente sedati con un 1 / 20 di diluizione in acqua sistema di magazzino 4mg/ml di metanosolfonato tricaine. Gli stock sono immagazzinati congelati a-20C. In alternativa, gli embrioni possono essere eutanasia con il 20x magazzino tricaine. Gli embrioni di solito può essere proiettato anche se sono ancora in corion. Tuttavia, soprattutto se saranno fotografati, è una buona idea per rimuovere il chorions con pinze taglienti. Gli embrioni possono essere visualizzati dopo la messa in diapositive depressione nella soluzione tricaine, o per meglio immobilizzare per la fotografia inseriti in una piccola goccia del 3% metilcellulosa.
3. Osservare fenotipi embrione in quelli iniettati con la combinazione di Morpholinos rispetto al morphants singolo. Qui stiamo cercando il modello di espressione GFP nel tubo cuore primordiale. In questo GFP ceppo reporter è espresso esclusivamente nei cardiomiociti attraverso il promotore cmlc2, che consente un'analisi dettagliata di specifiche cardiaca e il tubo di morfogenesi del cuore.

Rappresentante Risultati

Nel nostro esperimento, sia il gata5 e gata6 morphants singolo spettacolo riproducibile fenotipi cardiaci quando iniettato con livelli di soglia, anche se vi è una notevole variabilità biologica ^3,4. Per esempio, la maggior parte dei gata5 morphants generare un cuore bifido, con l'espressione GFP situati in due regioni. Ciò si verifica perché i progenitori cardiaci non riescono a migrare correttamente a fondere la linea mediana durante la formazione del cuore tubo. Tuttavia, alcune delle gata5 morphants fare generare un tubo difettoso cuore, e in un piccolo numero (5%) vi è una significativa diminuzione nella quantità di cellule GFP +. Crediamo che questo rifletta variabilità biologica, ma può anche essere dovuto al fatto che Morpholinos non sono equivalenti a una mutazione "null".

Allo stesso modo, il gata6 morphants mostrano un fenotipo cardiaco, ma vi è una gamma di fenotipi tra cui un piccolo numero di bifido riscalda, e cuori che sono disturbati morfologiche rispetto al controllo uninjected embrioni. Questa variabilità non è insolito per un fenotipo morfogenetica cardiaco, dal momento che la formazione di cuore è un processo dinamico e almeno una parte del fenotipo cardiaco può essere dovuto indirettamente embrionale difetti morfogenetici. Tuttavia, soprattutto, la gamma di difetti cardiaci morfogenetica per morphants sia gata5 e gata6 è coerente e riproducibile, e per la maggior parte degli embrioni generare sostanziali cardiomiociti GFP +.

In netto contrasto con la gata5 e gata6 morphants singolo, gli embrioni impoverito di entrambi i fattori mostrano una completa perdita di espressione GFP, coerente con una perdita di cardiomiociti. Così, gata5 e gata6 hanno ciascuno non ridondante funzioni per la morfogenesi cardiaca, ma i due geni sono funzionalmente ridondanti in un requisito per la generazione di cardiomiociti differenziati. I nostri studi precedenti hanno mostrato anche una perdita dei primi marcatori di cardiomiociti, tra cui nkx2.5, suggerendo un requisito per la specifica dei cardiomiociti ^3.

Discussion

Nell'esperimento descritto qui, abbiamo unito due Morpholinos, ognuna delle quali da sola di generare una gamma di fenotipi distinti, e ha trovato un fenotipo completamente diverso quando sono stati co-iniettata insieme. Naturalmente, avevamo bisogno di una giustificazione per fare questo esperimento, in primo luogo. Avevamo il sospetto che i due geni potrebbe compensare l'un l'altro per una funzione in precedenza, in questa specifica caso cardiaco. Questo perché i geni sono altamente correlate (e in grado di legarsi alle sequenze del DNA stesso) e sono espressi in sovrapposizione di modelli durante l'embriogenesi ^5. Inoltre, esperimenti di genetica in Drosophila ha indicato che i fattori di trascrizione GATA dovrebbe essere richiesto per la specifica cardiaca ^6.

Tuttavia, ci sono altre situazioni che questa strategia potrebbe essere utilizzato per la prova ridondanza funzionale o più in generale per le interazioni genetiche. In primo luogo, l'abbattimento di uno o di entrambi i geni potrebbero non generare alcun fenotipo evidente. In questo caso, non esiste un livello di soglia definito per ogni gene, e la quantità di morfolino da utilizzare saranno definiti empiricamente, limitata da quanto sono ben tollerati dalla embrioni. Ancora una volta, la logica di risarcimento di prova sarà probabilmente che i geni sono altamente correlati e da confermare co-espressione modelli. In secondo luogo, le interazioni genetiche possono essere testati per ogni coppia di geni mediante sotto-soglia quantità di Morpholinos. In questa strategia, il quantitativo massimo che non genera un fenotipo viene utilizzato per ogni morfolino. Se combinando Morpholinos genera un fenotipo, questo fornisce una forte evidenza di una interazione genetico, anche se può essere molto indiretto o addirittura rappresentare percorsi paralleli. In terzo luogo, co-iniezione di secondo morfolino può salvare il fenotipo del primo, se i due geni interagiscono in modo antagonista (che a loro volta possono essere indiretta). Mentre non vi è alcun limite definito al numero di geni differenti possono essere mirati, in un certo senso pratico è probabilmente geni 3-4, a seconda della quantità di ogni morfolino che è necessario per una risposta soglia.

Anche se questo approccio generale di utilizzare genetica inversa per rivelare le funzioni del gene nuovo è relativamente elevato throughput, ci sono una serie di avvertimenti a considerare per il Morpholinos. Prima di combinare Morpholinos, notevole sforzo è necessario per validare i singoli reagenti, se questo non sia già stato compiuto. Ogni singolo morfolino potrebbe non funzionare, mentre altri possono generare off-targeting "artefatto" fenotipi particolarmente associata con l'attivazione di apoptosi diffusa. I reagenti non sono economici, e se due o più Morpholinos sono necessari per convalidare ogni gene, questo investimento può essere significativo.

Considerazioni diverse possono guidare la strategia sperimentale.

i) Esiste un fenotipo mutante conosciuto? Se è così, un unico feno-copia morfolino dovrebbe essere sufficiente.

ii) Vi è un anticorpo disponibile? Se è così, una traduzione-bloccante può essere preferito, in caso contrario, sarà importante per documentare che una giunta-bloccante obiettivi in ​​modo efficace il pre-mRNA.

iii) È possibile salvare la morphant mediante iniezione di mRNA? Se funziona, si fornisce la prova eccellente per la specificità morfolino. Tuttavia, può spesso non funziona, a causa di errori di mira del mRNA iniettato. Salvataggio potrebbe anche essere testati utilizzando trasposoni a base di transgenesi, poiché questo potrebbe consentire un controllo più stretto spaziale e temporale più espressione del gene bersaglio. In entrambi i casi, è importante assicurarsi che il gene di salvataggio non è interessato dagli morfolino.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fish breeder tanks and dividers	Aquatic Habitats
Fish nets	Aquatic Habitats
System water			60mg Instant Ocean” per liter dH2O
100mm Petri dishes	BD Biosciences	351029
Micropipette needle puller	Sutter Instrument Co.	P-97 Flaming/Brown
3.5" glass capillaries	Drummond Scientific	3-000-203-G/X
Razor blade	Personna Medical Care	94-120-71
Micro grinder	Narishige International	EG-4
Gridded microscope eyepiece	Premiere	MF-02
Micrometer	WARD’s Natural Science	94 W 9910
Ultrapure agarose	Invitrogen	15510-027
Spatula	Fisher Scientific	14-357Q
Scale	Mettler Toledo	AB54-S/FACT
Disposable weigh dishes	Fisher Scientific	2-202-B
Conventional microwave	GE Healthcare
Erlenmeyer flask	Corning	4980
Microscope slides	Fisher Scientific	12-552
Graduated cylinder	Fisher Scientific	08-572-6D
Automatic pipette man	BrandTech	2026333
70% ethanol wash solution	Tarr	801VWR
N2 tank	Tech Air
Microinjector	Harvard Apparatus	PLI-100
Micromanipulator	Micro Instruments	LTD
Dissecting microscope	Nikon Instruments	SMZ1500
Parafilm	American National Can	PM-992
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904
Kimwipes	Kimberly-Clark Corporation	34155
gata5 splice site morpholino	Genetools, LLC		5’-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3’
gata5 ATG Blocker	Genetools, LLC		5’-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3’
gata6 Long Isoform ATG Blocker	Genetools, LLC		5’-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3’
Disposable Pasteur Pipette	Fisher Scientific	13-678-20B
Tricaine Methanesulfonate	Argent Labs	MS-222
Methycellulose	ICN Biomedicals	155495
Heat Block	Fisher Scientific	11-718-4
Sharp forceps	Dumont		Size 55
Depression Microslides	VWR international	48339-009