ストレプトゾシン治療:1型糖尿病のゼブラフィッシュモデル

Overview

このビデオでは、糖尿病合併症と代謝記憶の病態生理を研究するために、薬物ストレプトゾシンの助けを借りて1型糖尿病のゼブラフィッシュモデルを作成する技術について説明します。

Protocol

1. 糖尿病のゼブラフィッシュの発生、DMフィッシュ

1. 回復と麻酔水タンクの両方を準備します。回収水は通常の魚の水です。麻酔水の場合は十分な2-フェノキシエタノールを加え、通常の魚の水に1:1,000の希釈が達成されるようにします。
2. ストレプトゾシン(STZ)の0.3%溶液(ヒュームフード)を調製し、2mlのSTZを0.09%塩化ナトリウムの2mlに加え、すぐに溶液を氷の上に置きます。これにより、20分で約20匹の魚を注射するのに十分な注射液が提供されます。20分を超えた場合は、停止して、新しいSTZソリューションを作成してから続行してください。別のチューブアリコートで十分な生理食塩水を制御魚.STZが可溶化されると、後続のすべてのステップは、ヒュームフードの使用を必要としません。
3. 27 1/2ゲージ針を装備した1/2 ccのシリンジにSTZまたは制御液を充填して、気泡が閉じ込めないようにします。
4. 麻酔水中に魚を入れて各魚を個別に麻酔し、泳ぐ動きが止まるまで待ちます(1-2分)。
5. 麻酔をしたら、余分な水を吸収するために紙タオルの上に魚を短時間置き、魚を計量ボートに乗せられ、魚の質量を測定します。
6. 魚をしっかりした表面(ペトリ皿の蓋)に置き、注射します。
7. 腹側腹膜の後部にベベルを通り過ぎて針を挿入することによって、STZまたは制御溶液を魚の腹腔に注入する。
8. 0.35 mg/g (350 mg/kg) の STZ は各魚に送達され、必要な 0.3% 溶液の量は以下の方法で計算できます。
   1. 必要な mg で STZ の量を得るために 0.35 魚の質量 (g) を乗算します。
   2. 上記で生成された製品を3で割って、μlでの注入に必要な0.3%溶液の体積を得ます。
      サンプル: 0.5 g 魚の場合 : a) 0.5 x 0.35 = 0.175 b) .0175/3 = 0.058 ml = 58 μl.
      STZなしの同じボリュームは、コントロール魚のために注入されます.魚の質量ごとに注入するボリュームのシートを生成し、迅速な参照のために使用する必要があります。
9. 注射に続いて、魚を回収水槽に入れ、通常の水泳活動を監視します。これが達成されると、魚は22°C-24°Cの減温範囲で維持される正常な生きているタンクに移される。 この温度の低下は、高血糖(糖尿病、DM)の効率的な誘導のために重要です。
10. 高血糖は最初の注射の24時間以内に検出されるが、ゼブラフィッシュは非常に高血糖の長期状態を誘発するためには、以下に示すように毎週の維持注射を続けて頻繁に注射誘導を必要とする。

第1週:3回注射(1日目、3日目、5回)、第2週:1注射(12日目)、第3週:1回注射(19日目)、第4週:(21日目)対象のアッセイを行う。

この時点でゼブラフィッシュは、高血糖の長期状態にあったと考えられ、網膜症、腎症およびまたフィン再生障害の糖尿病合併症を示す。これらはDM魚と呼ばれます。さらに、必要に応じて、魚は毎週のメンテナンス注射で高血糖状態に維持することができます。このプロセス中に約5%の死亡が予想される。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptozocin	Sigma Aldrich	S0130
2 phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
Scalpel (size 10)	Fisher Scientific	089275A
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle	Fisher Scientific	305620
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.