Streptozocin Behandling: En zebrafisk Model af type 1 diabetes Mellitus

Overview

Denne video beskriver teknikken til at skabe en zebrafisk model for type 1 diabetes mellitus ved hjælp af lægemidlet Streptozocin, for at studere patofysiologi af diabetiske komplikationer og metabolisk hukommelse.

Protocol

1. Generation af zebrafisk med diabetes mellitus, DM Fisk

1. Forbered både nyttiggørelse og bedøvelse vandtanke. Recovery vand er normalt fiskevand. For bedøvelsesvand tilsættes tilstrækkelig 2-phenoxyethanol, således at der opnås en 1:1.000 fortynding i normalt fiskevand.
2. Der fremstilles en 0,3% opløsning (i en røghætte) af streptozocin (STZ) ved at tilsætte 6 mg STZ til 2 ml 0,09% natriumchlorid og straks placere opløsningen på is . Dette vil give tilstrækkelig injektionsopløsning til injektion af ca. 20 fisk på 20 minutter. Hvis du overskrider 20 minutters mærket, skal du stoppe og lave en frisk STZ-opløsning, før du fortsætter. I et separat rør aliquot nok saltvandsopløsning til kontrol fisk. Når STZ er opløselig, kræver alle efterfølgende trin ikke brug af røghætte.
3. Fyld en 1/2 cc sprøjte udstyret med en 27 1/2 gauge nål med STZ eller kontrolløsninger, der sikrer, at ingen luftbobler er fanget.
4. Bedøve hver fisk individuelt ved at placere fisken i bedøvelsesvand og vente, indtil deres svømmebevægelse ophører (1-2 min).
5. Når bedøvet kort placere fisk på et køkkenrulle til at absorbere overskydende vand, placere fisk i veje båd og måle massen af fisken.
6. Placer fisken på en fast overflade (Petri parabol låg) til injektion.
7. Indsprøjt STZ eller kontrolopløsningen i fiskens peritoneale hulrum ved at indsætte nålen forbi facetten i det bageste aspekt af det ventrale peritoneum.
8. Der skal leveres 0,35 mg/g (350 mg/kg) STZ til hver fisk, og mængden af den krævede opløsning på 0,3 % kan beregnes på følgende måde.
   1. Multiplicer massen af fisk (g) med 0,35 for at give den krævede mængde STZ i mg.
   2. det produkt, der er genereret ovenfor, divideres med 3 for at give det volumen af 0,3 %-opløsningen, der kræves til injektion i μl.
      Prøve: For en fisk på 0,5 g : a) 0,5 x 0,35 = 0,175 b) 0,0175/3= 0,058 ml = 58 μl.
      Det samme volumen uden STZ ville blive injiceret for en kontrol fisk. Der bør genereres et ark for mængder, der skal injiceres pr. fiskemasse, og som anvendes til hurtig reference.
9. Efter injektion placerer fisken i bjærgningsvandtanken og overvåger dem for normal svømmeaktivitet. Når dette er opnået, overføres fisken til en normal levende tank, der holdes ved det reducerede temperaturområde på 22 °C - 24 °C. Denne reducerede temperatur er afgørende for effektiv induktion af hyperglykæmi (diabetes mellitus, DM).
10. Selv om hyperglykæmi påvises inden for 24 timer efter den første injektion, kræver zebrafisken for at fremkalde en langvarig tilstand med meget høj hyperglykæmi en hyppig injektionsinduktionsfase efterfulgt af ugentlige vedligeholdelsesindsprøjtninger som vist nedenfor.

Uge 1: 3 injektioner (Dag 1, 3, 5), Uge 2: 1 injektion (Dag 12), Uge 3: 1 injektion (Dag 19), Uge 4: (Dag 21) Udfør analyse af interesse.

På dette tidspunkt zebrafisk anses for at have været i en langvarig tilstand af hyperglykæmi og udviser diabetiske komplikationer af retinopati, nefropati og også nedsat fin regenerering. Disse kaldes DM fisk. Derudover, hvis det ønskes fisken kan opretholdes i hyperglykæmisk tilstand med ugentlige vedligeholdelse injektioner. Ca. 5% død under denne proces bør forventes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptozocin	Sigma Aldrich	S0130
2 phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
Scalpel (size 10)	Fisher Scientific	089275A
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle	Fisher Scientific	305620
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.