Streptozocin behandling: En sebrafisk modell av type 1 diabetes mellitus

Overview

Denne videoen beskriver teknikken for å lage en sebrafiskmodell for type 1 diabetes mellitus ved hjelp av stoffet Streptozocin, for å studere patofysiologien til diabetikerkomplikasjoner og metabolsk minne.

Protocol

1. Generering av sebrafisk med diabetes mellitus, DM-fisk

1. Forbered både utvinning og bedøvelse av vanntanker. Recovery vann er normalt fiskevann. For bedøvelsesvann tilsett tilstrekkelig 2-fenoxyetanol slik at en 1:1000 fortynning i normalt fiskevann oppnås.
2. Forbered en 0,3% løsning (i en avtrekkshette) av streptozocin (STZ) ved å tilsette 6 mg STZ til 2 ml 0,09% natriumklorid og legg straks løsningen på is . Dette vil gi nok injeksjonsvæske, oppløsning til injeksjon av ca. 20 fisk på 20 min. Hvis du overskrider 20-minuttersmerket, må du stoppe og lage en ny STZ-løsning før du fortsetter. I et eget rør aliquot nok saltløsning for kontrollfisk. Når STZ er solubilized alle påfølgende trinn krever ikke avtrekk hette bruk.
3. Fyll en 1/2 cc sprøyte utstyrt med en 27 1/2 gauge nål med STZ eller kontrollløsninger som sikrer at ingen luftbobler er fanget.
4. Bedøv hver fisk individuelt ved å plassere fisken i bedøvelsesvann, og vent til svømmebevegelsen opphører (1-2 min).
5. Når du er bedøvet, legg fisken kort på et papirhåndkle for å absorbere overflødig vann, plasser fisken i veiebåten og mål fiskens masse.
6. Legg fisken på et fast underlag (Petri parabolenlokk) for injeksjon.
7. Injiser STZ eller kontrollløsningen i fiskens bukhule ved å sette nålen forbi skråkanten inn i det bakre aspektet av det ventrale bukhinnen.
8. 0,35 mg/g (350 mg/kg) STZ skal leveres til hver fisk, og volumet av den nødvendige oppløsningen på 0,3 % kan beregnes på følgende måte.
   1. Multipliser massen av fisk (g) med 0,35 for å gi den nødvendige mengden STZ i mg.
   2. del produktet som genereres ovenfor med 3 for å gi volumet av 0,3% oppløsning som kreves for injeksjon i μl.
      Prøve: For en 0,5 g fisk : a) 0,5 x 0,35 = 0,175 b) .0175/3= 0,058 ml = 58 μl.
      Det samme volumet uten STZ ville bli injisert for en kontrollfisk. Et ark for volumer som skal injiseres per fiskemasse, bør genereres og brukes som hurtigreferanse.
9. Etter injeksjon plasser fisken i utvinning vanntanken og overvåke dem for normal svømmeaktivitet. Når dette er oppnådd, overføres fisken til en vanlig stue som opprettholdes ved redusert temperaturområde på 22 °C - 24 °C. Denne reduserte temperaturen er avgjørende for effektiv induksjon av hyperglykemi (diabetes mellitus, DM).
10. Selv om hyperglykemi påvises innen 24 timer etter den første injeksjonen, for å indusere en langvarig tilstand av svært høy hyperglykemi, krever sebrafisken en hyppig injeksjonsinduksjonsfase etterfulgt av ukentlige vedlikeholdsinjeksjoner som vist nedenfor.

Uke 1: 3 injeksjoner (dag 1, 3, 5), uke 2: 1 injeksjon (dag 12), uke 3: 1 injeksjon (dag 19), uke 4: (dag 21) Utfør analyser av interesse.

På dette tidspunktet anses sebrafisken å ha vært i en langvarig tilstand av hyperglykemi og viser diabetiske komplikasjoner av retinopati, nefropati og også nedsatt finregenerering. Disse kalles DM-fisk. I tillegg kan fisken opprettholdes i hyperglykemisk tilstand med ukentlige vedlikeholdsinjeksjoner. Omtrent 5% død under denne prosessen bør forventes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptozocin	Sigma Aldrich	S0130
2 phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
Scalpel (size 10)	Fisher Scientific	089275A
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle	Fisher Scientific	305620
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.