Streptozocinbehandling: En zebrafiskmodell av typ 1-diabetes Mellitus

Overview

Denna video beskriver tekniken för att skapa en zebrafiskmodell för typ 1 diabetes mellitus med hjälp av läkemedlet Streptozocin, för att studera patofysiologi av diabetiker komplikationer och metaboliskt minne.

Protocol

1. Generation av zebrafisk med diabetes mellitus, DM Fish

1. Förbered både återhämtning och bedövningsvattentankar. Återvinningsvatten är normalt fiskvatten. För bedövningsmedel tillsätt tillräckligt med 2-fenoxietanol så att en utspädning på 1:1 000 i normalt fiskvatten uppnås.
2. Bered en 0,3% lösning (i en rökhuv) av streptozocin (STZ) genom att tillsätta 6 mg STZ till 2 ml 0,09% natriumklorid och omedelbart placera lösningen på is . Detta ger tillräckligt med injektionslösning för injektion av cirka 20 fiskar på 20 minuter. Om du överskrider 20-minutersmarkeringen, stanna och gör en ny STZ-lösning innan du fortsätter. I ett separat rör aliquot tillräckligt saltlösning för kontroll fisk. När STZ är löslig kräver alla efterföljande steg inte användning av rökhuven.
3. Fyll en 1/2 cc spruta utrustad med en 27 1/2 gauge nål med STZ eller styrlösningar som säkerställer att inga luftbubblor fångas.
4. Bedöva varje fisk individuellt genom att placera fisken i bedövningsvatten och vänta tills deras simrörelse upphör (1-2 min).
5. När fisken har sövts kort placera fisken på en pappershandduk för att absorbera eventuellt överflödigt vatten, placera fisken i vägbåten och mät fiskens massa.
6. Placera fisken på en fast yta (Petri skållock) för injektion.
7. Injicera STZ eller kontrolllösningen i fiskens peritoneala hålighet genom att föra in nålen förbi avfasningen i den bakre aspekten av ventrala bukhinnan.
8. 0,35 mg/g (350 mg/kg) STZ bör levereras till varje fisk och volymen av den 0,3% lösning som krävs kan beräknas på följande sätt.
   1. Multiplicera fiskmassan (g) med 0,35 för att ge den mängd STZ i mg som krävs.
   2. dividera produkten som genereras ovan med 3 för att ge volymen av den 0,3% lösning som krävs för injektion i μl.
      Prov: För en fisk på 0,5 g: a) 0,5 x 0,35 = 0,175 b) .0175/3= 0,058 ml = 58 μl.
      Samma volym utan STZ skulle injiceras för en kontrollfisk. Ett blad för volymer att injicera per fiskmassa bör genereras och användas som snabbreferens.
9. Efter injektion placera fisken i återhämtningsvattentanken och övervaka dem för normal simaktivitet. När detta har uppnåtts överförs fisken till en normal levande tank som hålls vid det reducerade temperaturområdet 22 °C - 24 °C. Denna reducerade temperatur är avgörande för effektiv induktion av hyperglykemi (diabetes mellitus, DM).
10. Även om hyperglykemi detekteras inom 24 timmar efter den första injektionen, för att inducera ett långvarigt tillstånd av mycket hög hyperglykemi kräver zebrafisken en frekvent injektionsinduktionsfas följt av veckovisa underhållsinjektioner enligt nedan.

Vecka 1: 3 injektioner (dag 1, 3, 5), vecka 2: 1 injektion (dag 12), vecka 3: 1 injektion (dag 19), vecka 4: (dag 21) Utför intresseanalys.

Vid denna tidpunkt zebrafish anses ha varit i ett långvarigt tillstånd av hyperglykemi och uppvisar diabetiker komplikationer av retinopati, nefropati och även nedsatt fin regenerering. Dessa kallas DM-fisk. Dessutom om så önskas kan fisken bibehållas i hyperglykemiskt tillstånd med veckovisa underhållsinjektioner. Cirka 5% död under denna process bör förväntas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Streptozocin	Sigma Aldrich	S0130
2 phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
Scalpel (size 10)	Fisher Scientific	089275A
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle	Fisher Scientific	305620
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.