Summary
ويمكن أن تحجب وظيفة الجين في خسارة وظيفة من التجارب اذا كان هناك تعويض آخر الجينات. نموذج الزرد يوفر نسبيا عالية الإنتاجية وسائل للكشف عن التكرار وظيفية من هذا القبيل في الأجنة الحية.
Abstract
عادة ما يتم تعريف وظيفة الجين خلال مرحلة التطور الجنيني من فقدان وظيفة ، من التجارب ، على سبيل المثال عن طريق الطفرات المستهدفة (خروج المغلوب) في الماوس. في النموذج الزرد ، وقد وضعت التقنيات الجينية العكسية الفعالة باستخدام microinjection من العقاقير morpholinos الجينات المحددة. Morpholinos استهداف مرنا من خلال المزاوجة قاعدة محددة وظيفة الجين كتلة عابر عن طريق الترجمة أو تثبيط الربط لعدة أيام خلال مرحلة التطور الجنيني (ضربة قاضية). ومع ذلك ، في الفقاريات مثل الماوس أو الزرد ، ويمكن حجب بعض وظائف الجينات بواسطة هذه الأساليب بسبب وجود جين آخر أن يعوض عن الخسارة. هذا صحيح خصوصا بالنسبة للأسر تحتوي على جينات المورثات الشقيقة التي شاركت في وأعرب في نفس الأنسجة النامية. في الزرد ، ويمكن اختبارها التعويض وظيفية بطريقة الإنتاجية العالية نسبيا ، عن طريق الحقن المشترك للmorpholinos أن الهدف ضربة قاضية لكل من الجينات في وقت واحد. وبالمثل ، وذلك باستخدام morpholinos ، يمكن أن يكون أظهر تفاعل الجينات الوراثية بين أي اثنين من ضربة قاضية لكل من الجينات معا في شبه عتبة المستويات. على سبيل المثال ، يمكن معاير morpholinos بحيث لا ضربة قاضية فرد يولد النمط الظاهري. إذا ، في ظل هذه الظروف ، وشارك في كل من الحقن morpholinos يسبب النمط الظاهري ، يظهر التفاعل الجيني. نحن هنا لشرح كيفية اظهار التكرار وظيفية في سياق اثنين من العوامل المتصلة النسخ غاتا. غاتا عوامل ضرورية لتحديد الأسلاف القلب ، ولكن كشف هذا فقط بسبب فقدان كل من Gata5 وGata6. نعرض كيفية اجراء تجارب microinjection ، التحقق من صحة morpholinos ، وتقييم التعويض عن النمط الظاهري تخلق القلب.
Protocol
هدفنا هنا هو لاختبار التكرار الوظيفي للعوامل النسخ اثنان للمواصفات cardiomyocyte الأسلاف. يتم ترميز العوامل التي تتعلق الجينين gata5 وgata6 ونحن باستخدام نموذج الزرد لفهم وظائف النسبية 1. استراتيجيتنا هي لمنع استخدام وظائف الجينات morpholinos 2. سنضخ morpholinos لأحد أو جينات أخرى في بويضات مخصبة ، ومقارنة مع النمط الظاهري الجنينية المستمدة من أجنة البيض حقن في وقت واحد مع كل من morpholinos. لتبسيط تقييم الظواهر ، ونحن نستخدم البيض المستمدة من الأسماك التي تحمل التحوير الذي يعبر في GFP العضلية.
الخطوة 1. التحضير لmicroinjection.
أ) إعداد أزواج تربية الأسماك
في المساء قبل الحقن ، ويتم وضع واحد من الذكور والإناث واحد الأسماك البالغة (3-18 شهرا من العمر) في أزواج في صهاريج مربي مفصولة المفرق حتى صباح اليوم التالي. نحن عادة تعيين ما يصل 10-20 زوجا من الأسماك ، وتزاوج هذه مرة واحدة في الأسبوع ، بغض النظر عما إذا كان سيتم استخدام البيض ، للحفاظ على الخصوبة. عن هذه التجربة ونحن نستخدم سلالة المراسل ، المعدلة وراثيا لcmlc2 : egfp ، لأنه يوفر قراءة بسيطة لتحديد العضلية التفريق. في صباح اليوم التالي ، عندما يتم تشغيل الأضواء ، يتم تغيير المياه ، ويتم سحبها من الدبابات فواصل السماح للأزواج الأسماك للتزاوج وانتاج البيض. يمكن رصده في إنتاج البيض ، ويمكن البدء فورا أو بعد فترة ساعة أو أكثر ، اعتمادا على الأسماك. عادة ، بعد حوالي 20 دقيقة من التزاوج دون انقطاع ، يتم جمع البيض باستخدام ماصة أو مصفاة وتدفقت إلى 100 ملم تحتوي على أطباق بتري المياه النظام. من المهم رصد إنتاج البيض من أجل ضمان أن يتم حقن الاجنة بين مرحلة الخلية 1-4. من خلال إطلاق عدة أزواج في وقت واحد ، فمن الممكن لارباك انتاج البيض وبالتالي تحقيق أقصى قدر من كمية البيض التي يمكن حقنها في المراحل التنموية في وقت مبكر. ويجوز للزوج جيد من الأسماك تولد أكثر من 200 الأجنة ، وانه لا معنى عمليا لجمع الآلاف من البيض في نفس الوقت ، منذ محقق واحد لن تكون قادرة على ضخها بسرعة كافية قبل أن تتطور إلى ما بعد مرحلة 4 خلايا . يتم تحفيز الأسماك لتولد الضوء على الدورة ، لذلك هذا هو التجربة التي يتطلب البدء في وقت مبكر ، وعدم الحصول على البيض عادة بعد الظهر.
ب) إعداد الإبر
- استخدام بولير Micropipette و3.5 أنبوب زجاجي "الشعرية لتوليد إبرتين باستخدام الشرط التالي : الحرارة = 626 ، سحب = 60 ، السرعة = 60 ، والوقت = 250 نستخدم الإبر الأساسية المفتوحة التي لا تحتوي على خيوط ، ل. نحن أمام ملء لهم الشفط.
- ثم هو غيض من كل إبرة مكسورة بلطف باستخدام شفرة حلاقة نظيفة أو الملقط ، ومشطوف لاحقا في زاوية 30 درجة عن 20 ثانية حول استخدام طاحونة صغيرة EG - 4. هذا غيض ويشحذ من المهم اذا كنت من خلال ضخ المشيماء.
- من المهم الحصول على إبرة قطرها ثابت حجم غيض من حوالي 15 ميكرون (4 وحدات ومعايرتها باستخدام المجهر العدسة الشبكية ، لتكون قادرة على معايرة حقن NL حجم 1-2).
- وينبغي إعداد الإبر مسبقا وتخزينها بشكل آمن في مكان آمن ، ويتم معايرة كل على حدة فقط قبل انطلاق الحقن لضمان ثابت حجم الحقن (انظر القسم دال للحصول على التفاصيل). إذا كنت محظوظا ، قد تكون قادرا على استخدام إبرة واحدة للتجربة بأكملها. ومع ذلك ، يمكن كسر بسهولة إبرة في منتصف تجربة ، وكنت لا تريد استخدام ذلك الوقت لسحب الإبر الجديدة.
ج) تقديم لوحات الحقن
- تحضير 100 مل من محلول agarose 2 ٪ في المياه النظام ، عن طريق الغليان في فرن الميكروويف.
- بارد لمسة ، وتصب نحو 12ml في غطاء المقلوب طبق بيتري 100mm.
- إدراج شرائح المجهر 2 ، مائلة على زوايا 45 درجة تقريبا ، إلى جانبي الغطاء. مرة واحدة وقد عززت agarose ، برفق الشرائح اثنتين من الغطاء.
- وهذا يخلق أجران حيث سيتم وضع الأجنة وحقنها في وقت لاحق. يمكن إعداد لوحات متعددة في وقت مبكر. ويمكن تخزينها لأجل غير مسمى في 4 درجات مئوية بعد إضافة طبقة من الايثانول 70 ٪ ، مضيفا أن الجزء السفلي من لوحة أصلية ، وختم مع parafilm. تذكر أن تغسل جيدا قبل استخدامها.
D) محطة Microinjection والمعايرة إبرة
- بدوره على مصدر النيتروجين مضغوطة وmicroinjector PLI - 100. ينبغي تعديل حاقن لضغط تدفق مستمر من 18 PSI.
- قبل إدخال إبرة ، أؤكد أن micromanipulator في موقف مناسب للسماح لمجموعة واسعة من الحركة ، وعلى أن الإبرة لن تضرب الطاولة. إدراج أحدالإبر أعدت من قبل (انظر القسم جيم) في micromanipulator التأكد من وجود ختم مشددة. يجب الحرص على عدم كسر الإبرة.
- مراقبة طرف إبرة تحت المجهر للتأكد من عدم انسداد قبل الشروع في المعايرة.
- وضع قطرة (2-3 ميكرولتر) من محلول الحقن أو DDH O 2 على قطعة صغيرة من parafilm وملء حوالي 1.5 ميكرولتر بسحبه إلى الإبرة باستخدام زر التعبئة. لا شك أن لديك معلومات سرية إبرة تماما في الحل ، ومراقبة شفط السوائل من خلال مجهر لتجنب الرسم في أي فقاعات هواء.
- وضع قطرة من الزيت المعدني على الشبكة من ميكرون.
- ضبط تجريبيا وقت الحقن لضمان أن حجم الانخفاض ما يقرب من 1.5 ميكرون في القطر. هذا وسوف يلقي حجم حقن NL 1.8 ~. ويمكن تعديل الحجم الفعلي لاختيارك ، ولكن من الناحية العملية من الصعب معايرة بدقة كميات أقل من 1 NL ، والأجنة قد لا تحمل كميات أعلاه NL 2. بغض النظر عن حجم وحدة التخزين التي تختارها ، ويبقيه على نفسها من أجل كل ما تبذلونه من الحقن بما في ذلك الضوابط ، وضبط تركيزات الحل (وليس حجم حقن) لمعايرة كمية morpholino حقن.
- من الضروري إعادة تقويم في كل مرة يتم استبدال إبرة ، لأن أحجام طرف الإبرة سوف تختلف.
الخطوة 2. التحقق من morpholinos استهداف اثنين من الجينات متميزة
صممت Morpholinos لاستهداف موقع أو مواقع الترجمة بدء لصق لحجب الهدف مرنا وبالتالي تخليق البروتين أو المعالجة المناسبة مرنا. عند تحليل الجينات للمرة الأولى ، ونحن نستخدم كلا النوعين من morpholinos لمعرفة ما إذا كانت تولد نفس النمط الظاهري ، مما يدل على ضربة قاضية معينة. ميزة من مانع ، لصق هو أنه يمكنك التحقق من ضربة قاضية للنسخة العادية بواسطة RT - PCR ، وهو أمر مفيد خصوصا إذا الأجسام المضادة لهذا الجين المستهدف ليست متوفرة. وسوف نوضح كيف يتم التوصل إلى النمط الظاهري يتفق القلب للجينات وgata5 gata6 باستخدام morpholinos (gata5 تسلسل MO 5'UTR : 5' - 3 - AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT '؛ gata5 تسلسل لصق MO الموقع : 5' - 3 - TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA' ؛ gata6 5 "تسلسل MO UTR : 5' - AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA - 3').
- ويتم الحصول على أدوات Morpholinos من الجينات ، LLC (Philomath ، OR). سوف الجين أدوات تساعدك على اختيار أفضل لتسلسل الهدف ، إذا كنت تسأل موظفيها الدعم. ما عليك سوى أن ترسل لهم رقم الانضمام ، وأنها سوف المشورة. ومع ذلك ، ليس هناك ما يضمن أن morpholino ستعمل ، وهذا هو السبب عليك أن تكون على استعداد للتحقق من صحة هذا النشاط. يمكنك الاختيار أيضا إذا morpholino يتوفر من OpenBiosystems. أدوات توفر مخزون الجينات morpholinos توليفها لOpenBiosystems. في حين أن هناك مرة أخرى لا يضمن أنه سوف يعمل ، فهي تبيع كميات صغيرة بتكلفة أقل ، والتي قد تساعد في تغطية تكاليف لاختبار الأهداف الجديدة. تأكد من BLAST morpholino الخاص ضد transcriptome ، ونحن نستخدم ميزة بلاط على المتصفح الجينوم UCSC الزرد (genome.ucsc.edu). بطبيعة الحال ، إذا كان قد تم المصادقة على morpholino (صارم) في الأدب ، فمن المستحسن أن تقوم بشراء هذا التسلسل ذاته.
- يذوب في morpholino DDH العقيمة 2 0 إلى تركيز النهائي من 1 ملم وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. لا تجميد الحلول morpholino ، كما لسبب انخفاض درجات الحرارة يمكن أن تسبب لهم في بعض الأحيان إلى تجميع وترسيب. Morpholinos لا تعير اهتماما لالبروتياز أو nucleases ، لذلك ما دام الماء إضافة عاقر ، فإنها ينبغي أن تكون آمنة تماما في درجة حرارة الغرفة.
- قبل عن طريق الحقن ، واحتضان morpholino عند 65 درجة مئوية ليذوب تماما 5 دقائق لضمان ذلك ، والسماح لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. لا تضع العينة على الجليد. إبقاء morpholino في درجة حرارة الغرفة حتى الحقن.
- ليعاير a morpholino ، ونحن نستعد عادة التخفيفات التسلسلي للتركيز الأسهم في DDH 2 0 لانتاج عمل تركيزات 1 ملم ، 0.5 ملم ، 0.25 ملم ، و0.125mM. تبعا للتسلسل ، وذلك باستخدام 1.8 NL حجم الحقن ، وهذا يمثل حوالي 20ng ، 10ng ، 5ng و2.5ng من morpholino في الحقن. هذا هو مجرد نقطة البداية ، لأن التسامح وفعالية كل morpholino سوف تختلف و لا يمكن التكهن بها. ولن يتم التسامح مع معظم morpholinos كثيرا أكثر من 20 نانوغرام ، ولكن البعض يمكن أن يكون فعالا في جرعات أقل بكثير من 1 نانوغرام. نهجنا هو تحديد تركيز الذي النمط الظاهري "الهضاب". وبعبارة أخرى ، إذا لم ير تعريفها باستخدام النمط الظاهري 2.5 نانوغرام ، ولكن استخدام اي مبلغ مماثل عند أو فوق 5 نغ ، سوف نختار 5 نانوغرام كمبلغ العتبة. بالطبع ، قد يكون من المفيد أن يعاير المقبل ما بين 2.5 نانوغرام ونانوغرام 5.0 ، لضمان أن كنت تعمل بتكاثر تتجاوز عتبة ، وليس من حق "على الحدود".
- شغل الإبرة المرفقة ومعايرتها(انظر أعلاه) مع أدنى تركيز عمل (أكثر تمييع) morpholino الحل. تجنب الإفراط في شغل الإبرة ، لأنها ببساطة سوف النفايات المادية. إذا كنت ملء سوى 1 ميكرولتر ، هناك حلا كافيا لحقن 500.
- باستخدام ماصة للتصرف ، ونقل خلية واحدة مخصبة - الأجنة في أحواض من لوحة microinjection. إزالة المياه الزائدة للتأكد من أن الأجنة يسقط على قاع أحواض الحقن. لا ينبغي أن تطفو ، ولكن بدلا من ذلك الالتزام السرير agarose.
- موقف لوحة الحقن بحيث يمكن أن ينحدر micromanipulator غيض من خلال إبرة والمشيماء في صفار للحقن. لوضع الأجنة الفردية ، والتعامل معها لوحة حقن مثل هذه غيض من إبرة الحقن أو يدفع يسحب الأجنة إلى الموضع الصحيح. يجب الحرص على عدم كسر غيض إبرة أو الضرر الأجنة! هذا يأخذ بعض الممارسة ، ولكن كقاعدة عامة استخدام micromanipulator ببساطة لتحريك إبرة الحقن في الجنين ومن ثم بعد الحقن ، وليس بسرعة وبطريقة نظيفة خارج. يتم إحضارها إلى موضع الحقن الأجنة عن طريق تحريك يدك باستخدام لوحة حرة (اليد اليسرى إذا قمت بحقن بيدك اليمنى). للمتعلم الجديد ، فمن المفيد أن ممارسة استخدام محلول يحتوي على أحمر الفينول 0.25 ٪ من أجل تصور حل حقن. اكتساب الثقة أيضا من خلال حقن محلول يحتوي على الفلورسنت الموسومة المجهرية (المسابر الجزيئية ؛ F - 8794) ، لتأكيد أن الحل هو حقن الجنين ، بدلا من المساحة المشتركة بين المشيماء. ومع ذلك ، وبعد بضع جولات من الناحية العملية ، وعادة ما تكون هذه المساعدات لم تعد مطلوبة. انها فكرة جيدة لحقن أحيانا في الهواء ، لمجرد التأكد من أن ليس انسداد الإبرة وأن حجم حقنها يبدو مناسبا.
- يتم نقل الأجنة حقنه مرة أخرى إلى طبق بيتري 100mm مع نظام المياه والمثقف في 28.5C. بعد حقن أقل تركيز العمل ، يمكن طرد أي حل المتبقية وثاني أعلى تركيز عمل morpholino تستخدم لملء الإبرة. كرر لكل تركيز morpholino. على الرغم من أنه من الممكن لشطف خارج الماء باستخدام إبرة ، وعندما اختبار morpholino متميزة ، ونحن نفضل أن تغير الإبر وإعادة تقويم. تأكد للحفاظ على الأتراب الأجنة uninjected إلى التحقق مما إذا كانت دفعة محددة من الأجنة في حالة صحية وطبيعية.
الخطوة 3. شارك في حقن بجرعات morpholinos العتبة الفردية
وكان الهدف من المعايرة نفذت أعلاه لتحديد الجرعة الحدية لكل morpholino. في أفضل السيناريوهات ، فإن الأساس 100 ٪ من morphants عرض تعريف النمط الظاهري ، إذا كان هذا الجين المستهدف له وظيفة أساسية. ومع ذلك ، هل يمكن أن نتوقع بعض التقلبات بسبب سوء الحقن التحف. مع الممارسة ، وهذا ينبغي ألا تتجاوز 10 ٪. قد يكون بعض دفعات من الأجنة (بما في ذلك ضوابط uninjected) لم البقاء على قيد الحياة بشكل جيد ، في هذه الحالة ، فإن التجربة قد تحتاج إلى مخفضة. وفي الوقت نفسه ، هناك أيضا تنوع البيولوجي ، لأن الأجنة الفردية قد يكون أكثر أو أقل تسامحا لضربة قاضية. أخيرا ، قد يكون بعض morpholinos فقط لا تكون فعالة بما فيه الكفاية لتحقيق قوية (توغل) ضربة قاضية. إذا تم إنشاء النمط الظاهري في انخفاض النسبة المئوية للأجنة ، ولكن يمكن استنساخه ، قد يكون من المفيد اختبار morpholino متميزة. الهدف من هذه التجربة التالية هي تحديد ما إذا كان شهد النمط الظاهري جديدة تماما عندما يتم استهداف كل من الجينات في وقت واحد. نحن لا نبحث عن مجرد زيادة في النسبة المئوية للأجنة التي لديها morphant النمط الظاهري ، بل لتوليد النمط الظاهري المتميزة التي لا ينظر عند أو فوق مستوى عتبة عند اختبار أي من الجينات الفردية.
- تحضير خليط من مزيج من morpholinos اختبارها من قبل ، في تركيز كل عتبة morpholino الفردية التي ولدت النمط الظاهري محددة. على سبيل المثال ، إذا كان الحد الأدنى لكل جينة و5 نانوغرام ، يعد الحل العمل التي سوف تحتوي على 5 + 5 نانوغرام في كل نانوغرام (10 نانوغرام مجموع). منذ الأجنة قد لا تحمل أكثر بكثير من 20 نانوغرام مجموع morpholino ، فمن المهم ، استنادا الى التجارب السابقة ، على استخدام الحد الأدنى من كل ذلك كاف لاستهداف كل بكفاءة الجينات.
- وينبغي أن الضوابط تشمل مجموعات من أجنة يحقن مع كل فرد وحده morpholino في نفس التركيز الذي تم استخدامه للمجموعة. ينبغي أن تظل أحجام حل الحقن المستمر (على سبيل المثال 1.8 NL). والميزة الكبرى لاستخدام سلالة المراسل هو أنه يمكنك تقييم النمط الظاهري (على سبيل المثال تمايز cardiomyocyte) في أي وقت ، وبشكل متكرر. إذا الأجنة التي يتم تقييمها للتعبير الجين بواسطة التهجين في الموقع ، يمكن ان تكون ثابتة مرحلة المطابقة الأجنة والضوابط في أوقات مختلفة بعد الحقن. لتجربتنا ، ونحن نذهب لتقييم التعبير GFP كبديل للتمايز cardiomyocyte ، في حوالي الساعة 24 HPF.
الخطوة 4. Eتقييم الظواهر
- وينبغي رصد الأجنة حقن ، بعد الحقن ، وعدة مرات خلال النهار ، لإزالة أي أجنة ميتة أو على وشك الموت ، لأن هذه يمكن أن ينال من صلاحية morphants المتبقية. لتقييم التعبير عن الجينات المراسل ، ويتم فحص الأجنة باستخدام مجهر تشريح تجهيزه بسعة مضان. نستخدم المجهر SMZ1500 نيكون ، مع هدف 1X أو 1.6X ومجموعة من التكبير من ل11.25x 0.75x. عند استخدام عامل تصفية الفلورسنت ، ومن المؤكد أن فتح الحجاب الحاجز إلى الإعداد مفتوحة بالكامل لتحقيق أقصى قدر من شدة الضوء. يمكن أيضا التأكد من استخدام فلتر الصحيح ، اعتمادا على الجينات مراسل (GFP ، RFP ، الخ).
- يتم عادة تحت التخدير باستخدام أجنة تخفيف 20/01 في شبكة المياه من المخزون 4mg/ml من methanesulfonate tricaine. يتم تخزين المخزون المجمد في دورتها الحادية و20C. بدلا من ذلك ، يمكن أن يتم التخلص أجنة باستخدام المخزون tricaine 20X. وعادة ما يمكن أن يكون فحص الأجنة حتى لو كانوا لا يزالون في المشيماء. ومع ذلك ، لا سيما إذا سيتم تصويرها ، انها فكرة جيدة لإزالة chorions باستخدام الملقط حادة. يمكن الاطلاع على الأجنة بعد وضع الشرائح في الاكتئاب في حل tricaine ، أو شل أفضل لهم للتصوير الفوتوغرافي وضعها في قطرة صغيرة من methylcellulose 3 ٪.
- مراقبة الجنين في تلك الظواهر حقن مع مجموعة من morpholinos مقارنة morphants واحد. هنا ونحن نبحث عن نمط التعبير GFP في أنبوب القلب البدائي. في هذا المراسل GFP سلالة يعبر حصرا في العضلية عبر المروج cmlc2 ، والذي يسمح تحليل مفصل للمواصفات القلب والقلب التشكل الأنبوب.
ممثل النتائج
في تجربتنا ، فإن كلا من morphants gata5 gata6 واحدة تظهر الظواهر استنساخه القلب عند حقنه مع المستويات الدنيا ، رغم أن هناك تفاوتا كبيرا 3،4 البيولوجية. على سبيل المثال ، فإن معظم morphants gata5 توليد قلب مشقوق ، مع التعبير GFP تقع في منطقتين. هذا يحدث بسبب فشل القلب الأسلاف لترحيل بشكل صحيح إلى الصمامات في خط الوسط خلال تشكيل أنبوب القلب. ومع ذلك ، فإن بعض morphants gata5 تفعل إنشاء أنبوب القلب المعيبة ، وكذلك في عدد صغير (5 ٪) وهناك انخفاض ملحوظ في كمية الخلايا + GFP. نحن نعتقد أن هذا يعكس التباين البيولوجي ، ولكن قد يكون أيضا بسبب حقيقة أن morpholinos لا يساوي طفرة "لاغية".
وبالمثل ، فإن morphants gata6 إظهار كل النمط الظاهري القلب ، ولكن هناك مجموعة من الظواهر من بينها عدد قليل من مشقوق تسخن ، ومضطربا مقارنة القلوب التي هي المورفولوجية للأجنة uninjected السيطرة. هذا التباين ليس من غير المألوف عن النمط الظاهري تخلقية القلب ، ومنذ تشكيل القلب هو عملية دينامية ، وعلى الأقل بعض من النمط الظاهري القلب قد يكون بسبب غير مباشر من العيوب التخلق الجنيني. ومع ذلك ، والأهم ، ومجموعة من العيوب تخلقية القلب على حد سواء لmorphants gata5 gata6 وثابت واستنساخه ، وبالنسبة للجزء الاكبر من الأجنة تولد كبيرة GFP + العضلية.
في تناقض صارخ مع morphants gata5 gata6 واحد ، كل من الأجنة المنضب العوامل تدل على فقدان كامل للتعبير GFP ، بما يتفق مع خسارة الخلايا العضلية. وهكذا ، وgata5 gata6 كل وظائف غير زائدة عن التشكل في القلب ، ولكن الجينات هما المكرر وظيفيا في شرط لتوليد الخلايا العضلية متباينة. وأظهرت دراساتنا السابقة ايضا خسارة من علامات أقرب cardiomyocyte ، بما في ذلك nkx2.5 ، مما يشير إلى الحاجة إلى مواصفات cardiomyocyte 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كنا معا في التجربة الموصوفة هنا ، وهما morpholinos ، كل وحدها التي تولد مجموعة متميزة من الظواهر ، والعثور على النمط الظاهري مختلفة تماما عندما كانت تشارك في حقن معا. بالطبع ، نحن في حاجة لتبرير القيام بهذه التجربة في المقام الأول. نحن يشتبه بأن الجينين قد تعوض بعضها البعض للحصول على وظيفة في وقت سابق ، في هذه الحالة مواصفات القلب. وذلك لأن غاية ترتبط الجينات (وقادرة على الربط إلى نفس تسلسل الحمض النووي) ، ويتم التعبير في أنماط متداخلة خلال مرحلة التطور الجنيني 5. وعلاوة على ذلك ، أشارت التجارب الجينية في ذبابة الفاكهة التي ينبغي أن يطلب من عوامل النسخ غاتا لمواصفات القلب 6.
ومع ذلك ، هناك حالات أخرى يمكن أن تستخدم هذه الاستراتيجية لاختبار التكرار وظيفية أو أكثر عموما عن التفاعلات الجينية. أولا ، قد يكون ضربة قاضية واحدة أو جينات كلا لا تولد أي النمط الظاهري واضح. في هذه الحالة ، لا يوجد أي مستوى العتبة المحددة لكل الجينات ، وسيتم تحديد مبلغ morpholino استخدام تجريبيا ، محدودة جيدا كيف يتم السكوت عليها من قبل الأجنة. مرة أخرى ، فإن الأساس المنطقي للحصول على تعويض من المرجح أن تكون التجارب التي ترتبط الجينات وعاليا من التعاون مؤكدا على التعبير عن الأنماط. ويمكن اختبار الثاني ، والتفاعلات الجينية لأي زوج الجينات باستخدام شبه عتبة مبالغ morpholinos. في هذه الاستراتيجية ، يتم استخدام المبلغ الأقصى الذي لا ينتج النمط الظاهري لكل morpholino. إذا كان الجمع بين morpholinos يولد النمط الظاهري ، وهذا يوفر دليلا قويا على التفاعل الجيني ، على الرغم من أنها قد تكون غير مباشرة جدا ، أو حتى تمثل مسارات متوازية. ربما الثالثة ، وشارك في حقن morpholino second انقاذ النمط الظاهري من الأولى ، إذا كان الجينين تتفاعل بطريقة عدائية (التي قد تكون غير مباشرة مرة أخرى). في حين لا يوجد حد لعدد محدد يمكن استهداف جينات مختلفة ، من الناحية العملية وربما هو الجينات 3-4 ، اعتمادا على كمية من كل morpholino أن هناك حاجة للاستجابة العتبة.
في حين أن هذا النهج العام من استخدام علم الوراثة لتكشف عن وظائف عكس الجين الجديد نسبيا عالية الإنتاجية ، وهناك عدد من المحاذير للنظر فيما يتعلق morpholinos. الجمع بين morpholinos قبل ، هناك حاجة إلى جهد كبير للتحقق من صحة الكواشف الفردية ، إذا كان هذا لم يتحقق بالفعل. أي واحد morpholino قد لا يعمل ، والبعض الآخر يمكن أن تولد خارج الاستهداف "الأداة" الظواهر المرتبطة بها وخاصة مع تفعيل الخلايا على نطاق واسع. الكواشف ليست رخيصة ، وإذا كان هناك حاجة لاثنين أو أكثر للتحقق من صحة كل morpholinos الجين ، وهذا الاستثمار يمكن أن تكون كبيرة.
قد اعتبارات عدة توجيه استراتيجية التجريبية.
ط) هل هناك النمط الظاهري المعروف متحولة؟ إذا كان الأمر كذلك ، ينبغي أن يكون واحد فينو للنسخ morpholino يكون كافيا.
ب) هل هناك الضد المتاحة؟ إذا كان الأمر كذلك ، قد يكون من المفضل ترجمة محصر ، وإذا لم يكن كذلك ، سيكون من المهم للوثيقة أن لصق محصر الأهداف بفعالية مرنا مسبقة.
هل الثالث) الذي انقاذ morphant عن طريق الحقن من مرنا؟ إذا كان هذا يعمل ، فإن ذلك يقدم دليلا ممتازا للخصوصية morpholino. ومع ذلك ، فإنه قد لا تعمل في كثير من الأحيان ، وذلك بسبب سوء استهداف مرنا حقن. ويمكن أيضا أن تختبر الانقاذ باستخدام ينقول المستندة transgenesis ، لأن هذا قد يسمح تشديد الرقابة المكانية والزمانية على التعبير عن الجينات المستهدفة. في كلتا الحالتين ، فإنه من الأهمية بمكان ضمان عدم استهداف الجين الانقاذ التي morpholino.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر أعضاء المختبر ايفانز لمساعدتهم في إعداد هذا العرض. تم التحقق من سلامة الأصل morpholinos المستخدمة هنا الدكتور أودري Holtzinger. وتدعم الشركة المصرية للاتصالات عن طريق المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (وHL064282 HL056182). وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعها المعهد لرعاية الحيوان واستخدام اللجنة ، من كلية طب وايل كورنيل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | ||
| Fish nets | Aquatic Habitats | ||
| System water | 60mg Instant Ocean” per liter dH2O | ||
| 100mm Petri dishes | BD Biosciences | 351029 | |
| Micropipette needle puller | Sutter Instrument Co. | P-97 Flaming/Brown | |
| 3.5" glass capillaries | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Razor blade | Personna Medical Care | 94-120-71 | |
| Micro grinder | Narishige International | EG-4 | |
| Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | |
| Micrometer | WARD’s Natural Science | 94 W 9910 | |
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | |
| Disposable weigh dishes | Fisher Scientific | 2-202-B | |
| Conventional microwave | GE Healthcare | ||
| Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552 | |
| Graduated cylinder | Fisher Scientific | 08-572-6D | |
| Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | |
| 70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | |
| N2 tank | Tech Air | ||
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | |
| Dissecting microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Parafilm | American National Can | PM-992 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5’-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3’ | |
| gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5’-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3’ | |
| gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5’-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3’ | |
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Tricaine Methanesulfonate | Argent Labs | MS-222 | |
| Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | |
| Heat Block | Fisher Scientific | 11-718-4 | |
| Sharp forceps | Dumont | Size 55 | |
| Depression Microslides | VWR international | 48339-009 |
References
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. Dev Biol. 312, 613-622 (2007).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Dev Biol. 311, 623-635 (2007).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata4 regulates the formation of multiple organs. Development. 132, 4005-4014 (2005).
- Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. GATA factors in Drosophila heart and blood cell development. Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).
