Un approccio inverso di test genetici per ridondanza funzionale durante l'embriogenesi
Summary
La funzione del gene può essere oscurato la perdita di funzione esperimenti se non vi è compensazione da un altro gene. Il modello di zebrafish fornisce un numero relativamente elevato throughput significa rivelare tale ridondanza funzionale negli embrioni viventi.
Abstract
La funzione del gene durante l'embriogenesi è tipicamente definito da perdita di funzione di esperimenti, per esempio mutagenesi mirata (eliminazione diretta) nel topo. Nel modello di zebrafish, efficaci tecniche della genetica inversa sono stati sviluppati utilizzando microiniezione di geni specifici per Morpholinos antisenso. Morpholinos un mRNA bersaglio attraverso specifici di base-accoppiamento e funzione genica bloccare transitoriamente dalla traduzione inibendo o splicing per diversi giorni durante l'embriogenesi (atterramento). Tuttavia, nei vertebrati come mouse o pesce zebra, alcune funzioni geniche possono essere oscurate da questi approcci per la presenza di un altro gene che compensa la perdita. Ciò è particolarmente vero per le famiglie di geni contenenti geni sorella che sono co-espressi nei tessuti stesso sviluppo. In zebrafish, compenso funzionale può essere testato in maniera relativamente elevato throughput, per co-iniezione di Morpholinos che knockdown obiettivo di entrambi i geni contemporaneamente. Allo stesso modo, usando Morpholinos, una interazione genetica tra due geni può essere dimostrato con atterramento di entrambi i geni insieme a livello sub-livelli di soglia. Per esempio, Morpholinos può essere titolata in modo tale che né i singoli knockdown genera un fenotipo. Se, in queste condizioni, co-iniezione di entrambi Morpholinos causa un fenotipo, una interazione genetica è mostrato. Qui mostriamo come mostrare ridondanza funzionale nel contesto di due fattori correlati trascrizione GATA. Fattori GATA sono essenziali per la specificazione dei progenitori cardiaco, ma questo si rivela solo dalla perdita di entrambi i Gata5 e Gata6. Mostriamo come svolgere esperimenti microiniezione, convalidare il Morpholinos, e valutare il fenotipo compensato cardiogenesis.
Protocol
Discussion
Nell'esperimento descritto qui, abbiamo unito due Morpholinos, ognuna delle quali da sola di generare una gamma di fenotipi distinti, e ha trovato un fenotipo completamente diverso quando sono stati co-iniettata insieme. Naturalmente, avevamo bisogno di una giustificazione per fare questo esperimento, in primo luogo. Avevamo il sospetto che i due geni potrebbe compensare l'un l'altro per una funzione in precedenza, in questa specifica caso cardiaco. Questo perché i geni sono altamente correlate (e in grado …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio Evans per il loro aiuto nella preparazione di questa presentazione. Il Morpholinos usato qui sono stati inizialmente convalidato dal Dr. Audrey Holtzinger. TE è supportato anche da finanziamenti del National Institutes of Health (HL064282 e HL056182). Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dall'Istituto per la cura degli animali e del Comitato uso, del Weill Cornell Medical College.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | |||
| Fish nets | Aquatic Habitats | |||
| System water | 60mg “Instant Ocean” per liter dH2O | |||
| 100mm Petri dishes | BD Falcon | 351029 | ||
| Micropipette needle puller | Sutter instruments, Co. | P-97 Flaming/Brown | ||
| 3.5″ glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | ||
| Razor blade | Personna | 94-120-71 | ||
| Micro grinder | Narishige, Japan | EG-4 | ||
| Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | ||
| Micrometer | Ward’s Natural Science | 94 W 9910 | ||
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | ||
| Spatula | Fisher | 14-357Q | ||
| Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | ||
| Disposable weigh dishes | Fisher | 2-202-B | ||
| Conventional microwave | General Electric | |||
| Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | ||
| Microscope slides | Fisher | 12-552 | ||
| Graduated cylinder | Fisher | 08-572-6D | ||
| Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | ||
| 70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | ||
| N2 tank | Tech Air | |||
| Microinjector | Harvard apparatus | PLI-100 | ||
| Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ1500 | ||
| Parafilm | American National Can | PM-992 | ||
| Mineral oil | Sigma | M5904 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | ||
| gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5′-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3′ | ||
| gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3′ | ||
| gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3′ | ||
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
| Tricaine Methanesulfonate | Argent Chemical Laboratories | MS-222 | ||
| Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | ||
| Heat Block | Fisher | 11-718-4 | ||
| Sharp forceps | Dumont | Size 55 | ||
| Depression Microslides | VWR | 48339-009 |
References
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. Dev Biol. 312, 613-622 (2007).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Dev Biol. 311, 623-635 (2007).
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