Summary

Un approccio inverso di test genetici per ridondanza funzionale durante l'embriogenesi

Published: August 11, 2010
doi:

Summary

La funzione del gene può essere oscurato la perdita di funzione esperimenti se non vi è compensazione da un altro gene. Il modello di zebrafish fornisce un numero relativamente elevato throughput significa rivelare tale ridondanza funzionale negli embrioni viventi.

Abstract

La funzione del gene durante l'embriogenesi è tipicamente definito da perdita di funzione di esperimenti, per esempio mutagenesi mirata (eliminazione diretta) nel topo. Nel modello di zebrafish, efficaci tecniche della genetica inversa sono stati sviluppati utilizzando microiniezione di geni specifici per Morpholinos antisenso. Morpholinos un mRNA bersaglio attraverso specifici di base-accoppiamento e funzione genica bloccare transitoriamente dalla traduzione inibendo o splicing per diversi giorni durante l'embriogenesi (atterramento). Tuttavia, nei vertebrati come mouse o pesce zebra, alcune funzioni geniche possono essere oscurate da questi approcci per la presenza di un altro gene che compensa la perdita. Ciò è particolarmente vero per le famiglie di geni contenenti geni sorella che sono co-espressi nei tessuti stesso sviluppo. In zebrafish, compenso funzionale può essere testato in maniera relativamente elevato throughput, per co-iniezione di Morpholinos che knockdown obiettivo di entrambi i geni contemporaneamente. Allo stesso modo, usando Morpholinos, una interazione genetica tra due geni può essere dimostrato con atterramento di entrambi i geni insieme a livello sub-livelli di soglia. Per esempio, Morpholinos può essere titolata in modo tale che né i singoli knockdown genera un fenotipo. Se, in queste condizioni, co-iniezione di entrambi Morpholinos causa un fenotipo, una interazione genetica è mostrato. Qui mostriamo come mostrare ridondanza funzionale nel contesto di due fattori correlati trascrizione GATA. Fattori GATA sono essenziali per la specificazione dei progenitori cardiaco, ma questo si rivela solo dalla perdita di entrambi i Gata5 e Gata6. Mostriamo come svolgere esperimenti microiniezione, convalidare il Morpholinos, e valutare il fenotipo compensato cardiogenesis.

Protocol

Il nostro obiettivo è quello di testare la ridondanza funzionale di due fattori di trascrizione per la specificazione dei progenitori dei cardiomiociti. I fattori sono codificate da due geni correlati gata5 e gata6 e stiamo utilizzando il modello zebrafish per capire le loro relative funzioni 1. La nostra strategia è bloccare la funzione del gene utilizzando Morpholinos 2. Noi inietterà Morpholinos per l'uno o l'altro gene in uova fecondate, e confrontare il fenotipo em…

Discussion

Nell'esperimento descritto qui, abbiamo unito due Morpholinos, ognuna delle quali da sola di generare una gamma di fenotipi distinti, e ha trovato un fenotipo completamente diverso quando sono stati co-iniettata insieme. Naturalmente, avevamo bisogno di una giustificazione per fare questo esperimento, in primo luogo. Avevamo il sospetto che i due geni potrebbe compensare l'un l'altro per una funzione in precedenza, in questa specifica caso cardiaco. Questo perché i geni sono altamente correlate (e in grado …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo i membri del laboratorio Evans per il loro aiuto nella preparazione di questa presentazione. Il Morpholinos usato qui sono stati inizialmente convalidato dal Dr. Audrey Holtzinger. TE è supportato anche da finanziamenti del National Institutes of Health (HL064282 e HL056182). Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dall'Istituto per la cura degli animali e del Comitato uso, del Weill Cornell Medical College.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Fish breeder tanks and dividers   Aquatic Habitats    
Fish nets   Aquatic Habitats    
System water       60mg “Instant Ocean” per liter dH2O
100mm Petri dishes   BD Falcon 351029  
Micropipette needle puller   Sutter instruments, Co. P-97 Flaming/Brown  
3.5″ glass capillaries   Drummond 3-000-203-G/X  
Razor blade   Personna 94-120-71  
Micro grinder   Narishige, Japan EG-4  
Gridded microscope eyepiece   Premiere MF-02  
Micrometer   Ward’s Natural Science 94 W 9910  
Ultrapure agarose   Invitrogen 15510-027  
Spatula   Fisher 14-357Q  
Scale   Mettler Toledo AB54-S/FACT  
Disposable weigh dishes   Fisher 2-202-B  
Conventional microwave   General Electric    
Erlenmeyer flask   Corning 4980  
Microscope slides   Fisher 12-552  
Graduated cylinder   Fisher 08-572-6D  
Automatic pipette man   BrandTech 2026333  
70% ethanol wash solution   Tarr 801VWR  
N2 tank   Tech Air    
Microinjector   Harvard apparatus PLI-100  
Micromanipulator   Micro Instruments LTD  
Dissecting microscope   Nikon SMZ1500  
Parafilm   American National Can PM-992  
Mineral oil   Sigma M5904  
Kimwipes   Kimberly-Clark 34155  
gata5 splice site morpholino   Genetools, LLC   5′-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3′
gata5 ATG Blocker   Genetools, LLC   5′-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3′
gata6 Long Isoform ATG Blocker   Genetools, LLC   5′-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3′
Disposable Pasteur Pipette   Fisher Scientific 13-678-20B  
Tricaine Methanesulfonate   Argent Chemical Laboratories MS-222  
Methycellulose   ICN Biomedicals 155495  
Heat Block   Fisher 11-718-4  
Sharp forceps   Dumont   Size 55
Depression Microslides   VWR 48339-009  

References

  1. Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
  2. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
  3. Holtzinger, A., Evans, T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. Dev Biol. 312, 613-622 (2007).
  4. Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Dev Biol. 311, 623-635 (2007).
  5. Holtzinger, A., Evans, T. Gata4 regulates the formation of multiple organs. Development. 132, 4005-4014 (2005).
  6. Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. GATA factors in Drosophila heart and blood cell development. Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).

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Cite This Article
Rikin, A., Rosenfeld, G. E., McCartin, K., Evans, T. A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis. J. Vis. Exp. (42), e2020, doi:10.3791/2020 (2010).

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