胚形成の間に機能的な冗長性をテストするための逆遺伝学的アプローチ
Summary
別の遺伝子による補償がある場合は、遺伝子の機能は、機能喪失実験で隠されることができる。ゼブラフィッシュのモデルは、生きている胚ではそのような機能的な冗長性を明らかにするために、比較的高スループットの手段を提供します。
Abstract
胚発生時の遺伝子の機能は通常、マウスにおける標的特異的変異（ノックアウト）するなどして、機能喪失実験によって定義されています。ゼブラフィッシュのモデルでは、効果的な逆遺伝学的手法は、遺伝子特異的アンチセンスモルフォのマイクロインジェクションを使用して開発されました。モルフォは、胚発生（ノックダウン）の間に数日間のための翻訳を阻害するか、選択的スプライシングによって一過性に特異的塩基対形成とブロックの遺伝子の機能を介してmRNAをターゲットとしています。しかし、マウスやゼブラフィッシュなどの脊椎動物では、いくつかの遺伝子の機能は、損失を補償する他の遺伝子の存在により、これらのアプローチによって隠されることができる。これは、同じ発展途上の組織で共発現している姉妹の遺伝子を含む遺伝子ファミリーのために特に当てはまります。ゼブラフィッシュでは、機能的な補償は、その同時に両遺伝子のターゲットのノックダウンモルフォの同時注入によって、比較的高スループットな方法でテストすることができます。同様に、モルフォを使用して、任意の2つの遺伝子間の遺伝的相互作用は、サブスレッショルドレベルで一緒に両遺伝子のノックダウンによって実証することができます。例えば、モルフォは、どちらも個々のノックダウンは、表現型を生成するように滴定することができます。 、これらの条件下で、両方モルフォの同時注入が表現型を引き起こす場合、遺伝的相互作用が示されています。ここでは2つの関連GATA転写因子のコンテキスト内で機能的な冗長性を表示する方法を示します。 GATA因子は、心臓前駆細胞の仕様のために不可欠ですが、これはのみGata5とGata6両方の損失が明らかにされる。我々は、マイクロインジェクション実験を行うモルフォの検証、および心臓発生のための補償表現型を評価する方法を示します。
Protocol
Discussion
実験は、ここで説明では、我々は2つのモルフォ、単独で表現型の異なる範囲を生成、そのうち、それぞれを組み合わせて、それらが一緒に共同注入した全く異なる表現型を発見した。もちろん、我々は最初の場所でこの実験を行うための正当化を必要としていました。我々は2つの遺伝子が、この場合心臓の仕様で、以前の関数のためにお互いを補うかもしれないことを疑った。遺?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、このプレゼンテーションの準備で彼らの助けのためにエヴァンスの研究室のメンバーに感謝。ここで使用されるモルフォは、もともと博士オードリーHoltzingerにより検証された。 TEは、国立衛生研究所（HL064282とHL056182）からの補助金によってサポートされています。動物実験は、ワイルコーネル医科大学の動物実験委員会の研究所が定めるガイドラインおよび規則に従って、行われた。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | |||
| Fish nets | Aquatic Habitats | |||
| System water | 60mg “Instant Ocean” per liter dH2O | |||
| 100mm Petri dishes | BD Falcon | 351029 | ||
| Micropipette needle puller | Sutter instruments, Co. | P-97 Flaming/Brown | ||
| 3.5″ glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | ||
| Razor blade | Personna | 94-120-71 | ||
| Micro grinder | Narishige, Japan | EG-4 | ||
| Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | ||
| Micrometer | Ward’s Natural Science | 94 W 9910 | ||
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | ||
| Spatula | Fisher | 14-357Q | ||
| Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | ||
| Disposable weigh dishes | Fisher | 2-202-B | ||
| Conventional microwave | General Electric | |||
| Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | ||
| Microscope slides | Fisher | 12-552 | ||
| Graduated cylinder | Fisher | 08-572-6D | ||
| Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | ||
| 70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | ||
| N2 tank | Tech Air | |||
| Microinjector | Harvard apparatus | PLI-100 | ||
| Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ1500 | ||
| Parafilm | American National Can | PM-992 | ||
| Mineral oil | Sigma | M5904 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | ||
| gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5′-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3′ | ||
| gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3′ | ||
| gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3′ | ||
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
| Tricaine Methanesulfonate | Argent Chemical Laboratories | MS-222 | ||
| Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | ||
| Heat Block | Fisher | 11-718-4 | ||
| Sharp forceps | Dumont | Size 55 | ||
| Depression Microslides | VWR | 48339-009 |
References
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. Dev Biol. 312, 613-622 (2007).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Dev Biol. 311, 623-635 (2007).
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