Función de los genes puede ser oscurecida en los experimentos de la pérdida de función de si hay una compensación por otro gen. El modelo de pez cebra ofrece un relativamente alto rendimiento medio para revelar la redundancia funcional como en embriones vivos.
Función de los genes durante la embriogénesis se define por los experimentos de pérdida de función, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida (knockout) en el ratón. En el modelo de pez cebra, técnicas efectivas de genética inversa se han desarrollado mediante la microinyección de morfolinos antisentido de genes específicos. Morfolinos objetivo a través de un ARNm específico de apareamiento de bases y la función del gen bloquear transitoriamente por la traducción de inhibir o empalme por varios días durante la embriogénesis (caída). Sin embargo, en los vertebrados, como el ratón o el pez cebra, algunas funciones de los genes puede ser oscurecida por estos métodos debido a la presencia de otro gen que compensa la pérdida. Esto es especialmente cierto para las familias de genes que contienen genes de la hermana que son co-expresados en los mismos tejidos en desarrollo. En el pez cebra, la compensación funcional puede ser probado de una manera relativamente alto rendimiento, por co-inyección de morfolinos que se dirigen a la precipitación de los dos genes simultáneamente. Del mismo modo, con morfolinos, una interacción genética entre dos genes puede ser demostrado por la precipitación de ambos genes en conjunto en los niveles sub-umbral. Por ejemplo, morfolinos pueden ajustarse de manera que ni caída individual genera un fenotipo. Si, bajo estas condiciones, la co-inyección de ambos morfolinos causa un fenotipo, una interacción genética se muestra. Aquí se demuestra cómo mostrar redundancia funcional en el contexto de dos factores relacionados con la transcripción GATA. GATA factores son esenciales para la especificación de los progenitores cardíacos, pero esto sólo se revela por la pérdida de ambos GATA5 y Gata6. Se muestra cómo llevar a cabo experimentos de microinyección, validar los morfolinos, y evaluar el fenotipo compensado cardiogénesis.
En el experimento descrito aquí, combinamos dos morfolinos, cada uno de los cuales solo generan una gama de fenotipos distintos, y se encontró un fenotipo completamente diferente cuando se co-inyectados juntos. Por supuesto, necesitamos una justificación para hacer este experimento en el primer lugar. La sospecha de que los dos genes podría compensar entre sí por una función anterior, en este caso la especificación cardíaco. Esto se debe a los genes están muy relacionados (y capaces de unirse a secuencias de AD…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a los miembros del laboratorio de Evans por su ayuda en la preparación de esta presentación. Los morfolinos utilizadas aquí fueron validadas originalmente por el Dr. Audrey Holtzinger. TE es apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (HL064282 y HL056182). Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Instituto para la Protección de los Animales y el empleo, de la Weill Cornell Medical College.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | |||
Fish nets | Aquatic Habitats | |||
System water | 60mg “Instant Ocean” per liter dH2O | |||
100mm Petri dishes | BD Falcon | 351029 | ||
Micropipette needle puller | Sutter instruments, Co. | P-97 Flaming/Brown | ||
3.5″ glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | ||
Razor blade | Personna | 94-120-71 | ||
Micro grinder | Narishige, Japan | EG-4 | ||
Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | ||
Micrometer | Ward’s Natural Science | 94 W 9910 | ||
Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | ||
Spatula | Fisher | 14-357Q | ||
Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | ||
Disposable weigh dishes | Fisher | 2-202-B | ||
Conventional microwave | General Electric | |||
Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | ||
Microscope slides | Fisher | 12-552 | ||
Graduated cylinder | Fisher | 08-572-6D | ||
Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | ||
70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | ||
N2 tank | Tech Air | |||
Microinjector | Harvard apparatus | PLI-100 | ||
Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | ||
Dissecting microscope | Nikon | SMZ1500 | ||
Parafilm | American National Can | PM-992 | ||
Mineral oil | Sigma | M5904 | ||
Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | ||
gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5′-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3′ | ||
gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3′ | ||
gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3′ | ||
Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
Tricaine Methanesulfonate | Argent Chemical Laboratories | MS-222 | ||
Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | ||
Heat Block | Fisher | 11-718-4 | ||
Sharp forceps | Dumont | Size 55 | ||
Depression Microslides | VWR | 48339-009 |