Summary

En omvänd Genetisk strategi till Test Funktionell Redundans under fosterutvecklingen

Published: August 11, 2010
doi:

Summary

Genfunktion kan skymmas i förlust-av-funktionen experiment om det är ersättning av en annan gen. Den zebrafisk Modellen ger en relativt hög genomströmning betyder att avslöja sådant funktionell redundans i levande embryon.

Abstract

Geners funktion under fosterutvecklingen är normalt definieras av bortfall av funktionen experiment, till exempel genom riktad mutagenes (knockout) i musen. I zebrafisk-modellen, har effektiva omvända genetiska tekniker har utvecklats med hjälp av mikroinjektion av genspecifika antisens morpholinos. Morpholinos rikta ett mRNA genom särskilda bas-parning och block genfunktion övergående genom att hämma översättning eller skarva i flera dagar under fosterutvecklingen (knockdown). Men i ryggradsdjur såsom mus eller zebrafisk kan vissa genfunktioner skymmas av dessa metoder på grund av närvaron av en annan gen som kompenserar för förlusten. Detta gäller särskilt för genfamiljer innehåller syster gener som är co-uttrycks i samma utveckla vävnader. I zebrafisk, kan funktionell ersättning testas i en relativt hög genomströmning sätt, genom samtidig injektion av morpholinos som riktar ÖVERVÄLDIGANDE av både gener samtidigt. Likaså använder morpholinos kan en genetisk interaktion mellan två gener påvisas genom ÖVERVÄLDIGANDE av både gener tillsammans på sub-tröskelvärdena. Till exempel kan morpholinos titreras så att varken enskilda ÖVERVÄLDIGANDE genererar en fenotyp. Om under dessa förhållanden orsakar co-injektion av både morpholinos en fenotyp, är en genetisk interaktion. Här visar vi hur du visa funktionell redundans i samband med två faktorer GATA transkription. GATA faktorer är viktiga för specifikation av hjärt progenitorceller, men detta är avslöjade bara av förlusten av både Gata5 och Gata6. Vi visar hur man genomför mikroinjektion experiment, validera morpholinos och utvärdera kompenseras fenotypen för cardiogenesis.

Protocol

Vårt mål här är att testa den funktionella uppsägning av två transkriptionsfaktorer för specifikation av cardiomyocyte stamceller. Faktorerna kodas av två gener gata5 och gata6 och vi använder zebrafisk modell för att förstå deras relativa funktioner 1. Vår strategi är att blockera geners funktion med hjälp av morpholinos 2. Vi kommer att injicera morpholinos för den ena eller andra genen i befruktade ägg, och jämföra den embryonala fenotypen med embryon från ?…

Discussion

I experimentet som beskrivs här, tillsammans vi två morpholinos, som var ensam genererar en distinkt olika fenotyper, och fann en helt annan fenotyp när de var tillsammans injiceras tillsammans. Naturligtvis behövde vi en motivering för att göra detta experiment i första hand. Vi misstänkte att de två generna kan kompensera varandra för en tidigare funktion, i detta fall hjärt-specifikation. Detta beror på att generna är mycket relaterade (och kan binda till samma DNA-sekvenser) och uttrycks i överlappande…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi tackar medlemmar av Evans laboratorium för deras hjälp att förbereda denna presentation. Den morpholinos används här var ursprungligen godkänts av Dr Audrey Holtzinger. TE stöds av anslag från National Institutes of Health (HL064282 och HL056182). Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av Institutet för djurens skötsel och användning kommittén, av Weill Cornell Medical College.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Fish breeder tanks and dividers   Aquatic Habitats    
Fish nets   Aquatic Habitats    
System water       60mg “Instant Ocean” per liter dH2O
100mm Petri dishes   BD Falcon 351029  
Micropipette needle puller   Sutter instruments, Co. P-97 Flaming/Brown  
3.5″ glass capillaries   Drummond 3-000-203-G/X  
Razor blade   Personna 94-120-71  
Micro grinder   Narishige, Japan EG-4  
Gridded microscope eyepiece   Premiere MF-02  
Micrometer   Ward’s Natural Science 94 W 9910  
Ultrapure agarose   Invitrogen 15510-027  
Spatula   Fisher 14-357Q  
Scale   Mettler Toledo AB54-S/FACT  
Disposable weigh dishes   Fisher 2-202-B  
Conventional microwave   General Electric    
Erlenmeyer flask   Corning 4980  
Microscope slides   Fisher 12-552  
Graduated cylinder   Fisher 08-572-6D  
Automatic pipette man   BrandTech 2026333  
70% ethanol wash solution   Tarr 801VWR  
N2 tank   Tech Air    
Microinjector   Harvard apparatus PLI-100  
Micromanipulator   Micro Instruments LTD  
Dissecting microscope   Nikon SMZ1500  
Parafilm   American National Can PM-992  
Mineral oil   Sigma M5904  
Kimwipes   Kimberly-Clark 34155  
gata5 splice site morpholino   Genetools, LLC   5′-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3′
gata5 ATG Blocker   Genetools, LLC   5′-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3′
gata6 Long Isoform ATG Blocker   Genetools, LLC   5′-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3′
Disposable Pasteur Pipette   Fisher Scientific 13-678-20B  
Tricaine Methanesulfonate   Argent Chemical Laboratories MS-222  
Methycellulose   ICN Biomedicals 155495  
Heat Block   Fisher 11-718-4  
Sharp forceps   Dumont   Size 55
Depression Microslides   VWR 48339-009  

References

  1. Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
  2. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
  3. Holtzinger, A., Evans, T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. Dev Biol. 312, 613-622 (2007).
  4. Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Dev Biol. 311, 623-635 (2007).
  5. Holtzinger, A., Evans, T. Gata4 regulates the formation of multiple organs. Development. 132, 4005-4014 (2005).
  6. Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. GATA factors in Drosophila heart and blood cell development. Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).

Play Video

Cite This Article
Rikin, A., Rosenfeld, G. E., McCartin, K., Evans, T. A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis. J. Vis. Exp. (42), e2020, doi:10.3791/2020 (2010).

View Video