En omvänd Genetisk strategi till Test Funktionell Redundans under fosterutvecklingen
Summary
Genfunktion kan skymmas i förlust-av-funktionen experiment om det är ersättning av en annan gen. Den zebrafisk Modellen ger en relativt hög genomströmning betyder att avslöja sådant funktionell redundans i levande embryon.
Abstract
Geners funktion under fosterutvecklingen är normalt definieras av bortfall av funktionen experiment, till exempel genom riktad mutagenes (knockout) i musen. I zebrafisk-modellen, har effektiva omvända genetiska tekniker har utvecklats med hjälp av mikroinjektion av genspecifika antisens morpholinos. Morpholinos rikta ett mRNA genom särskilda bas-parning och block genfunktion övergående genom att hämma översättning eller skarva i flera dagar under fosterutvecklingen (knockdown). Men i ryggradsdjur såsom mus eller zebrafisk kan vissa genfunktioner skymmas av dessa metoder på grund av närvaron av en annan gen som kompenserar för förlusten. Detta gäller särskilt för genfamiljer innehåller syster gener som är co-uttrycks i samma utveckla vävnader. I zebrafisk, kan funktionell ersättning testas i en relativt hög genomströmning sätt, genom samtidig injektion av morpholinos som riktar ÖVERVÄLDIGANDE av både gener samtidigt. Likaså använder morpholinos kan en genetisk interaktion mellan två gener påvisas genom ÖVERVÄLDIGANDE av både gener tillsammans på sub-tröskelvärdena. Till exempel kan morpholinos titreras så att varken enskilda ÖVERVÄLDIGANDE genererar en fenotyp. Om under dessa förhållanden orsakar co-injektion av både morpholinos en fenotyp, är en genetisk interaktion. Här visar vi hur du visa funktionell redundans i samband med två faktorer GATA transkription. GATA faktorer är viktiga för specifikation av hjärt progenitorceller, men detta är avslöjade bara av förlusten av både Gata5 och Gata6. Vi visar hur man genomför mikroinjektion experiment, validera morpholinos och utvärdera kompenseras fenotypen för cardiogenesis.
Protocol
Discussion
I experimentet som beskrivs här, tillsammans vi två morpholinos, som var ensam genererar en distinkt olika fenotyper, och fann en helt annan fenotyp när de var tillsammans injiceras tillsammans. Naturligtvis behövde vi en motivering för att göra detta experiment i första hand. Vi misstänkte att de två generna kan kompensera varandra för en tidigare funktion, i detta fall hjärt-specifikation. Detta beror på att generna är mycket relaterade (och kan binda till samma DNA-sekvenser) och uttrycks i överlappande…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar medlemmar av Evans laboratorium för deras hjälp att förbereda denna presentation. Den morpholinos används här var ursprungligen godkänts av Dr Audrey Holtzinger. TE stöds av anslag från National Institutes of Health (HL064282 och HL056182). Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av Institutet för djurens skötsel och användning kommittén, av Weill Cornell Medical College.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | |||
| Fish nets | Aquatic Habitats | |||
| System water | 60mg “Instant Ocean” per liter dH2O | |||
| 100mm Petri dishes | BD Falcon | 351029 | ||
| Micropipette needle puller | Sutter instruments, Co. | P-97 Flaming/Brown | ||
| 3.5″ glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | ||
| Razor blade | Personna | 94-120-71 | ||
| Micro grinder | Narishige, Japan | EG-4 | ||
| Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | ||
| Micrometer | Ward’s Natural Science | 94 W 9910 | ||
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | ||
| Spatula | Fisher | 14-357Q | ||
| Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | ||
| Disposable weigh dishes | Fisher | 2-202-B | ||
| Conventional microwave | General Electric | |||
| Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | ||
| Microscope slides | Fisher | 12-552 | ||
| Graduated cylinder | Fisher | 08-572-6D | ||
| Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | ||
| 70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | ||
| N2 tank | Tech Air | |||
| Microinjector | Harvard apparatus | PLI-100 | ||
| Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ1500 | ||
| Parafilm | American National Can | PM-992 | ||
| Mineral oil | Sigma | M5904 | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | ||
| gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5′-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3′ | ||
| gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3′ | ||
| gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5′-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3′ | ||
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
| Tricaine Methanesulfonate | Argent Chemical Laboratories | MS-222 | ||
| Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | ||
| Heat Block | Fisher | 11-718-4 | ||
| Sharp forceps | Dumont | Size 55 | ||
| Depression Microslides | VWR | 48339-009 |
References
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. Dev Biol. 312, 613-622 (2007).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Dev Biol. 311, 623-635 (2007).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata4 regulates the formation of multiple organs. Development. 132, 4005-4014 (2005).
- Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. GATA factors in Drosophila heart and blood cell development. Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).
