Summary
Genfunktion kan skymmas i förlust-av-funktionen experiment om det är ersättning av en annan gen. Den zebrafisk Modellen ger en relativt hög genomströmning betyder att avslöja sådant funktionell redundans i levande embryon.
Abstract
Geners funktion under fosterutvecklingen är normalt definieras av bortfall av funktionen experiment, till exempel genom riktad mutagenes (knockout) i musen. I zebrafisk-modellen, har effektiva omvända genetiska tekniker har utvecklats med hjälp av mikroinjektion av genspecifika antisens morpholinos. Morpholinos rikta ett mRNA genom särskilda bas-parning och block genfunktion övergående genom att hämma översättning eller skarva i flera dagar under fosterutvecklingen (knockdown). Men i ryggradsdjur såsom mus eller zebrafisk kan vissa genfunktioner skymmas av dessa metoder på grund av närvaron av en annan gen som kompenserar för förlusten. Detta gäller särskilt för genfamiljer innehåller syster gener som är co-uttrycks i samma utveckla vävnader. I zebrafisk, kan funktionell ersättning testas i en relativt hög genomströmning sätt, genom samtidig injektion av morpholinos som riktar ÖVERVÄLDIGANDE av både gener samtidigt. Likaså använder morpholinos kan en genetisk interaktion mellan två gener påvisas genom ÖVERVÄLDIGANDE av både gener tillsammans på sub-tröskelvärdena. Till exempel kan morpholinos titreras så att varken enskilda ÖVERVÄLDIGANDE genererar en fenotyp. Om under dessa förhållanden orsakar co-injektion av både morpholinos en fenotyp, är en genetisk interaktion. Här visar vi hur du visa funktionell redundans i samband med två faktorer GATA transkription. GATA faktorer är viktiga för specifikation av hjärt progenitorceller, men detta är avslöjade bara av förlusten av både Gata5 och Gata6. Vi visar hur man genomför mikroinjektion experiment, validera morpholinos och utvärdera kompenseras fenotypen för cardiogenesis.
Protocol
Vårt mål här är att testa den funktionella uppsägning av två transkriptionsfaktorer för specifikation av cardiomyocyte stamceller. Faktorerna kodas av två gener gata5 och gata6 och vi använder zebrafisk modell för att förstå deras relativa funktioner 1. Vår strategi är att blockera geners funktion med hjälp av morpholinos 2. Vi kommer att injicera morpholinos för den ena eller andra genen i befruktade ägg, och jämföra den embryonala fenotypen med embryon från ägg injiceras samtidigt med båda morpholinos. För att förenkla utvärderingen av fenotyper använder vi ägg som härrör från fisk som bär en transgen som uttrycker GFP i cardiomyocytes.
Steg 1. Förberedelser för mikroinjektion.
A) Inrättande av häckande par av fisk
Kvällen före injektion, är ensamstående män och ensamstående kvinnliga vuxen fisk (3-18 månader) placeras i par till uppfödare tankar åtskilda av en skiljevägg till nästa morgon. Vi sätter vanligtvis upp 10-20 par av fisk, och dessa är parad en gång i veckan, oavsett om äggen kommer att användas, för att upprätthålla fruktsamhet. För detta experiment använder vi en reporter stam, transgena för cmlc2: EGFP, eftersom det ger en enkel avläsning för att identifiera skilja cardiomyocytes. Nästa morgon, när ljuset är påslagen, är vattnet förändrats, och avdelare dras från tankar så att fisken paren att para sig och producera ägg. Äggproduktion kan övervakas och kan omedelbart inleda, eller efter en period av en timme eller mer, beroende på fisk. Vanligtvis efter ungefär 20 minuters oavbruten parning, är ägg som samlats in med hjälp av en pipett eller sil och hälls i 100 mm petriskålar som innehåller system för vatten. Det är viktigt att följa upp äggproduktionen i syfte att säkerställa att embryon injiceras mellan 1-4 cellen scenen. Genom att släppa flera par åt gången, är det möjligt att sprida de äggproduktion och därmed maximera den mängd ägg som kan injiceras i ett tidigt utvecklingsstadium. Ett par bra fiskar kan generera mer än 200 embryon, och det gör ingen praktisk mening att samla in tusentals ägg samtidigt, eftersom en enda utredare inte skulle kunna injicera dem tillräckligt snabbt innan de utvecklar bortom 4-cells stadiet . Fisk stimuleras att avla på ljuset cykeln, så detta är ett experiment som kräver en tidig start, och ägg är oftast inte erhållits efter kl.
B) Förbereda nålar
- Använd en Mikropipett Avdragare och en 3,5 "glas kapillärrör för att generera två nålar med följande villkor: Värme = 626, Pull = 60, hastighet = 60, och Tid = 250 Vi använder öppen kärna nålar som inte innehåller en glödtråd, eftersom. Vi front-fylla dem med sug.
- Spetsen på nålen är sedan försiktigt bryts med en ren rakblad eller pincett, och därefter avfasade på en 30 graders vinkel i ca 20 sekunder med ett EG-4 mikro-kvarn. Detta skärper spets och är viktigt om du injicerar genom chorion.
- Det är viktigt att få en konsekvent st diameter spets på ca 15 my (kalibrerat som 4 enheter med en inrutade mikroskop okular, för att kunna kalibrera en 1-2 nl injektionsvolym).
- Stickor bör förberedas i förväg, förvaras säkert på en säker plats, och varje individuellt kalibrerad strax före start injektioner för att garantera konsekvent injektionsvolym (se avsnitt D för detaljer). Om du har tur kanske du kan använda en enda nål för en hel experiment. Däremot kan en nål lätt bryts mitt i ett experiment, och du inte vill använda den tiden för att dra nya nålar.
C) Göra injektion plattor
- Bereda 100 ml av en 2% agaroslösningen i systemet vatten genom kokning i en mikrovågsugn.
- Kyl vid beröring, och häll över 12ml i den uppochnedvända locket på en 100 mm petriskål.
- Sätt 2 objektglas, lutande på ungefär 45 graders vinkel in i två sidor av locket. När agarosen har stelnat drar du försiktigt i två bilder från locket.
- Detta skapar dalar där embryona kommer att placeras och därefter injiceras. Flera plattor kan förberedas i förväg. De kan förvaras under obegränsad tid vid 4 ° C efter att du lagt ett lager av 70% etanol, lägga ned den ursprungliga plattan, och tätning med parafilm. Kom ihåg att tvätta ordentligt innan användning.
D) mikroinjektion station och nål kalibrering
- Slå på Kvävgas källa och PLI-100 microinjector. Injektorn skall justeras för ett konstant flöde tryck 18 PSI.
- Innan du sätter i en nål, säkerställa att mikromanipulator är i lämpligt läge för att möjliggöra ett brett utbud av rörelse, och att en in nålen inte slår i tabellen. Sätt in en avnålar beredd tidigare (se avsnitt C) i mikromanipulator gör att det finns en tät försegling. Var noga med att inte bryta nålen.
- Observera nålspetsen under mikroskop för att se till att det inte är igensatt innan du fortsätter med kalibrering.
- Placera en droppe (2-3 l) av injektionslösningen eller DDH 2 O på en liten bit av parafilm och fyll ca 1,5 l genom att dra in den i nålen med hjälp fyllningen knappen. Se till att du har nålspetsen fullt ut i lösning och observera våtsugning i mikroskopet för att inte dra i några luftbubblor.
- Placera en droppe mineralolja på nätet av en mikrometer.
- Justera empiriskt tidpunkten för injektion för att säkerställa att droppstorleken är ungefär 1,5 mikrometer i diameter. Detta kommer att ge en injektion volym på ~ 1,8 nl. Den verkliga volymen kan anpassas till ditt val, men i praktisk mening är det svårt att exakt kalibrera volymer under 1 NL och embryon får inte tolerera volymer över 2 NL. Oavsett volymen storlek du väljer, håll den samma för alla dina injektioner, inklusive kontroller, och justera din lösning koncentrationer (snarare än injektion volym) för att titrera mängden insprutat morpholino.
- Omkalibrering är nödvändigt varje gång en nål ersätts, eftersom nålspetsen storlek kommer att variera.
Steg 2. Validering av morpholinos rikta två olika gener
Morpholinos är utformade för att rikta in sig på platsen översättningen inledandet eller platser skarva ett mål mRNA vilket förhindrar proteinsyntesen eller korrekt mRNA bearbetning. Vid analys av en gen för första gången använder vi båda typerna av morpholinos för att testa om de genererar samma fenotyp, vilket indikerar en viss knockdown. En fördel med skarv-blockerare är att du kan kontrollera ÖVERVÄLDIGANDE av den normala avskriften med RT-PCR, vilket är särskilt användbart om antikroppar för målgenen inte tillgängliga. Vi kommer att illustrera hur en konsekvent hjärt fenotyp uppnås för gata5 och gata6 gener med hjälp morpholinos (gata5 5'UTR MO sekvens: 5'-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3 "; gata5 Splice Site MO sekvens: 5'-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3"; gata6 5 'UTR MO sekvens: 5'-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3).
- Morpholinos erhålls från Gene Tools, LLC (Philomath, OR). Gene verktyg hjälper dig att välja den bästa sekvensen till målet, om du frågar deras supportpersonal. Du behöver bara skicka dem anslutningen nummer, och de kommer att råda. Det finns dock ingen garanti för att morpholino fungerar, varför du måste vara beredd att godkänna verksamheten. Du kan också kontrollera om morpholino finns från OpenBiosystems. Gene Tools tillhandahåller lager av syntetiskt morpholinos till OpenBiosystems. Medan det finns återigen ingen garanti för det kommer att fungera, de säljer mindre kvantiteter till en lägre kostnad, som kan hjälpa till att täcka kostnaderna för att testa nya mål. Var noga med att spränga din morpholino mot transkriptom, vi använder Blat funktionen på UCSC zebrafisk genomet webbläsare (genome.ucsc.edu). Självklart, om en morpholino har validerats (strikt) i litteraturen, är det rekommenderat att du köper samma sekvens.
- Den morpholino löses upp i steril DDH 2 0 till en slutlig koncentration av 1 mm och förvaras i rumstemperatur. FÅR EJ FRYSAS morpholino lösningar, som av någon anledning låga temperaturer kan ibland få dem att aggregera och fällning. Morpholinos är okänsliga för proteaser eller nukleaser, så länge vattnet du lägger till är steril, bör de vara ganska säkert vid rumstemperatur.
- Innan injicering, inkubera morpholino vid 65 ° C i 5 minuter för att försäkra den är helt upplöst och låt svalna till rumstemperatur. Placera INTE provet på is. Håll morpholino i rumstemperatur tills injektion.
- Att titrera en morpholino, förbereder vi vanligtvis seriella spädningar av beståndet koncentrationen i DDH 2 0 ge brukslösningar av 1 mm, 0,5 mm, 0,25 mm, och 0.125mM. Beroende på sekvens, med 1,8 nl av injektionsvolym motsvarar detta cirka 20ng, 10 ng, 5ng och 2.5ng av morpholino per injektion. Detta är bara en utgångspunkt, eftersom tolerans och effekt av varje morpholino kommer att variera och kan inte förutsägas. De flesta morpholinos tolereras inte mycket över 20 ng, men vissa kan vara effektivt vid doser långt under 1 ng. Vår strategi är att definiera den koncentration vid vilken en fenotyp "platåer". Med andra ord, om en definierad fenotyp inte ses med 2,5 ng, men är liknande med något belopp på eller över 5 ng, skulle vi välja 5 ng som en tröskel belopp. Naturligtvis kan det vara bra att nästa titrera mellan 2,5 ng och 5,0 ng, så att du arbetar reproducerbart bortom gränsen, snarare än rätt "på gränsen".
- Fyll bifogade och kalibreras nål(Se ovan) med den lägsta arbeta koncentration (mest utspädd) morpholino lösning. Undvik att fylla nålen, eftersom det kommer bara avfall. Om du fyller bara 1 l, det finns tillräcklig lösning för 500 injektioner.
- Med hjälp av en engångspipett, överföring befruktade en-cells embryon till dalar av mikroinjektion plattan. Ta bort överflödigt vatten för att säkerställa att embryon faller till botten av injektionen tråg. De bör inte flyta, utan snarare hålla sig till agaros sängen.
- Placera injektion plattan så att mikromanipulator kan stiga nålspetsen genom chorion och in i gulan för injektion. Att placera enskilda embryon, manipulera injektion plattan så att spetsen på kanylen skjuter eller drar embryon till rätt position. Var noga med att inte bryta nålspetsen eller embryon skador! Detta tar lite träning, men som regel du använder mikromanipulator helt enkelt att flytta injektionsnål in i embryot och sedan efter injektionen, ganska snabbt och snyggt ut. Embryon förs in injektion position genom att flytta plattan med den fria handen (vänster hand om du injicerar med höger hand). För en ny elev, är det bra att öva på att använda en lösning som innehåller 0,25% fenolrött för att visualisera den injicerade lösningen. Förtroende är också fått genom att injicera en lösning som innehåller fluorescerande-märkta mikrosfärer (molekylära sonder, F-8794), för att bekräfta att lösningen var injiceras i embryot, snarare än mellan chorion utrymme. Men efter några rundor av praktiken är dessa stöd vanligtvis inte längre behövs. Det är en god idé att då och då spruta i luften, bara för att bekräfta att nålen inte är igensatt och att den volym som injiceras verkar lämpligt.
- Injiceras embryon återförs till en 100mm petriskål med system vatten och odlade på 28.5C. Efter injektion av den lägsta arbeta koncentration kan eventuell kvarvarande lösning utvisas och det näst högsta arbetar koncentration av morpholino används för att fylla nålen. Upprepa för varje koncentration av morpholino. Även om det går att skölja ut nålen med vatten, vid provning av en distinkt morpholino, föredrar vi att byta nålar och kalibrera. Var noga med att hålla en kohort av uninjected embryon att kontrollera om de specifika parti embryon var frisk och normal.
Steg 3. Samtidig injektion av morpholinos på individuell tröskel doser
Målet för titreringen utförs ovan var att definiera en tröskel dos för varje morpholino. I bästa fall kommer huvudsakligen 100% av morphants visa en definierad fenotyp, om det drabbade genen har en viktig funktion. Du kan dock räkna med viss variation beroende på mis-injektion artefakter. Med praktiken bör detta inte överstiga 10%. Vissa partier av embryon (inklusive uninjected kontroller) kanske inte överlever väl, i vilket fall experimentet kan behöva diskonteras. Samtidigt finns det också biologisk variabilitet, eftersom enskilda embryon kan vara mer eller mindre toleranta till knockdown. Slutligen kan vissa morpholinos bara inte vara tillräckligt effektiva för att åstadkomma ett robust (spricksökning) knockdown. Om en fenotyp genereras i en låg andel av embryon, men är reproducerbar, kan det vara värt att pröva en distinkt morpholino. Målet med detta nästa experimentet är att avgöra om en helt ny fenotyp ses när båda generna är riktade samtidigt. Vi är inte bara ute efter en ökning i andelen embryon som har en morphant fenotyp, utan snarare för att generera en distinkt fenotyp som inte syns vid eller över gränsvärdet på när man testar någon av enskilda gener.
- Förbered en blandning av en kombination av morpholinos testats tidigare, på tröskeln koncentrationen för varje morpholino som genererade en definierad fenotyp. Till exempel, om tröskelvärdet för varje gen var 5 ng, förbereda en fungerande lösning som kommer att innehålla 5 ng + 5 ng av varje (10 ng totalt). Eftersom embryon som inte kan tolerera mycket mer än 20 ng totalt morpholino är det viktigt, baserat på tidigare försök, att använda minimal mängd av varje som är tillräcklig för att effektivt rikta varje gen.
- Kontrollerna bör omfatta uppsättningar av embryon injiceras med varje enskild morpholino ensam vid samma koncentration som användes för kombinationen. Volymerna av injektion Lösningen skall hållas konstant (t.ex. 1,8 nl). En stor fördel med att använda en reporter stam är att du kan utvärdera fenotypen (till exempel cardiomyocyte differentiering) som helst, och upprepade gånger. Om embryon skall utvärderas för genuttryck av in situ hybridisering, kan steget matchade embryon och kontroller fastställas vid olika tillfällen efter injektion. För vårt experiment kommer vi att utvärdera GFP uttryck som ett surrogat för cardiomyocyte differentiering, cirka 24 HPF.
Steg 4. Evärdering av fenotyper
- Injicerade embryon bör övervakas, precis efter injektionen, och flera gånger under dagen, att ta bort eventuella döda eller döende embryon, då detta kan äventyra lönsamheten för de kvarvarande morphants. För att utvärdera uttryck av reportern genen är embryon undersöks med hjälp av en dissekera mikroskop utrustad med fluorescens kapacitet. Vi använder en Nikon SMZ1500 mikroskop, med en 1X eller 1,6 x mål och ett område med förstoring mellan 0,75 x till 11.25x. När du använder en fluorescerande filter, se till att öppna membranet till helt öppen inställning för att maximera ljusintensiteten. Var också noga med att använda rätt filter, beroende på reportern gen (GFP, RFP, etc.).
- Embryon är oftast lugnande preparat med 1 / 20 utspädning i systemet vatten av 4mg/ml lager av tricaine methanesulfonate. Bestånden förvaras frysta vid-20C. Alternativt kan embryon avlivas med 20x tricaine lager. Embryon kan oftast undersökas även om de är kvar i chorion. Men särskilt om de kommer att bli fotograferade, det är en bra idé att ta bort chorions med vassa pincett. Embryon kan ses efter placering i depression bilder i tricaine lösning, eller att bättre immobilisera dem för fotografering placeras i en liten droppe 3% metylcellulosa.
- Observera embryo fenotyper i de injiceras med en kombination av morpholinos jämfört med samma morphants. Här är vi ute efter mönstret av GFP uttryck i den ursprungliga hjärtat röret. I den här reportern stam GFP uttrycks uteslutande i cardiomyocytes via cmlc2 promotor, som möjliggör detaljerad analys av hjärt-specifikation och hjärta rör morfogenes.
Representativa resultat
I vårt experiment, både gata5 och gata6 enda morphants visa reproducerbara hjärt fenotyper när injiceras med gränsvärden, även om det finns en stor biologisk variation 3,4. Till exempel, de flesta av de gata5 morphants generera en KLYVD hjärta, med GFP uttryck belägna i två regioner. Detta beror på att hjärtats stamceller inte migrera ordentligt för att säkringen vid mittlinjen under hjärtat röret bildas. Men några av de gata5 morphants genererar en defekt hjärta rör, och i ett fåtal (5%) finns det en betydande minskning av mängden av GFP + celler. Vi tror att detta speglar biologiska variationer, men kan också bero på att morpholinos inte är likvärdiga med en "null" mutation.
Likaså gata6 morphants visar alla en hjärt fenotyp, men det finns en rad olika fenotyper inklusive ett litet antal KLYVD värmer, och hjärtan som är morfologiska störda jämfört med uninjected kontroll embryon. Denna variation är inte ovanligt för en hjärt morfogenetiska fenotyp, eftersom hjärtat bildning är en dynamisk process och åtminstone en del av hjärtat fenotyp kan bero indirekt från embryonala morfogenetiska defekter. Men viktigare är att utbudet av hjärt morfogenetiska defekter både gata5 och gata6 morphants enhetliga och reproducerbara, och för det mesta embryona generera betydande GFP + cardiomyocytes.
I skarp kontrast till den gata5 och gata6 enda morphants, embryon utarmat både faktorer visar en total förlust av GFP uttryck, i överensstämmelse med en förlust av cardiomyocytes. Således gata5 och gata6 alla ha icke-redundanta funktioner för hjärt morfogenes, men de två gener är funktionellt överflödiga i ett krav för generering av differentierade cardiomyocytes. Våra tidigare studier visade också en förlust av de tidigaste cardiomyocyte markörer, däribland nkx2.5, vilket tyder på ett krav för cardiomyocyte specifikation 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I experimentet som beskrivs här, tillsammans vi två morpholinos, som var ensam genererar en distinkt olika fenotyper, och fann en helt annan fenotyp när de var tillsammans injiceras tillsammans. Naturligtvis behövde vi en motivering för att göra detta experiment i första hand. Vi misstänkte att de två generna kan kompensera varandra för en tidigare funktion, i detta fall hjärt-specifikation. Detta beror på att generna är mycket relaterade (och kan binda till samma DNA-sekvenser) och uttrycks i överlappande mönster under fosterutvecklingen 5. Vidare uppgav genetiska experiment i Drosophila att GATA transkriptionsfaktorer bör krävas för hjärt-specifikation 6.
Men det finns andra situationer som denna strategi kan användas för att testa funktionell redundans eller mer generellt för genetisk interaktion. Första kan ÖVERVÄLDIGANDE av en eller båda generna genererar inte någon uppenbar fenotyp. I detta fall finns det inget definieras tröskelnivån för varje gen, och mängden morpholino att använda kommer att definieras empiriskt, begränsas av hur väl de tolereras av embryon. Återigen kommer den logiska grunden för att testa ersättning troligt att de gener som är mycket relaterade och från bekräftar co-uttryck mönster. För det andra genetiska interaktioner kan testas för varje gen Para ihop med hjälp under gränsvärdena mängder morpholinos. I denna strategi är den maximala mängd som inte genererar en fenotyp som används för varje morpholino. Om kombinera båda morpholinos genererar en fenotyp, ger detta starka bevis för en genetisk interaktion, även om det kan vara ganska indirekt eller ens representerar parallella vägar. Tredje, co-insprutning av nästa morpholino kan rädda fenotyp av den första, om de två gener samverkar i ett antagonistiskt sätt (som återigen kan vara indirekt). Det finns inga definierade gräns för hur många olika gener kan riktas, i praktisk mening är det förmodligen 3-4 gener, beroende på mängden av varje morpholino som behövs för en tröskel svar.
Även om denna allmänna strategi för att använda omvänd genetik för att avslöja nya genfunktioner är relativt hög genomströmning, det finns ett antal förbehåll att överväga om morpholinos. Innan kombinera morpholinos är stora ansträngningar behövs för att validera enskilda reagenser, om detta inte redan har åstadkommit. Varje enskild morpholino kanske inte fungerar, medan andra kan generera off-targeting "artefakt" fenotyper särskilt förknippad med aktivering av omfattande apoptos. Reagensen är inte billiga, och om två eller fler morpholinos behövs för att validera varje gen, kan denna investering vara betydande.
Flera överväganden kan vägleda den experimentella strategi.
i) Finns det en känd mutant fenotyp? Om så är fallet bör en enda företeelser kopiering morpholino vara tillräckligt.
ii) Finns det en antikropp som finns? Om så är fallet kan en översättning-receptorblockerare att föredra, och om inte, är det viktigt att dokumentera att en skarv-blockerare effektivt målen i pre-mRNA.
iii) Kan du rädda morphant genom injektion av mRNA? Om detta fungerar, det ger goda bevis för morpholino specificitet. Det kan dock ofta inte fungerar på grund av mis-inriktning av den injicerade mRNA. Rescue kan också testas med hjälp transposon-baserade genmodifiering, eftersom detta kan ge hårdare rumsliga och tidsmässiga kontroll över uttrycket av de riktade genen. I båda fallen är det viktigt att se till att räddnings-gen inte är målet för den morpholino.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmar av Evans laboratorium för deras hjälp att förbereda denna presentation. Den morpholinos används här var ursprungligen godkänts av Dr Audrey Holtzinger. TE stöds av anslag från National Institutes of Health (HL064282 och HL056182). Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av Institutet för djurens skötsel och användning kommittén, av Weill Cornell Medical College.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | ||
| Fish nets | Aquatic Habitats | ||
| System water | 60mg Instant Ocean” per liter dH2O | ||
| 100mm Petri dishes | BD Biosciences | 351029 | |
| Micropipette needle puller | Sutter Instrument Co. | P-97 Flaming/Brown | |
| 3.5" glass capillaries | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Razor blade | Personna Medical Care | 94-120-71 | |
| Micro grinder | Narishige International | EG-4 | |
| Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | |
| Micrometer | WARD’s Natural Science | 94 W 9910 | |
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | |
| Disposable weigh dishes | Fisher Scientific | 2-202-B | |
| Conventional microwave | GE Healthcare | ||
| Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552 | |
| Graduated cylinder | Fisher Scientific | 08-572-6D | |
| Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | |
| 70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | |
| N2 tank | Tech Air | ||
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | |
| Dissecting microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Parafilm | American National Can | PM-992 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5’-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3’ | |
| gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5’-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3’ | |
| gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5’-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3’ | |
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Tricaine Methanesulfonate | Argent Labs | MS-222 | |
| Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | |
| Heat Block | Fisher Scientific | 11-718-4 | |
| Sharp forceps | Dumont | Size 55 | |
| Depression Microslides | VWR international | 48339-009 |
References
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. Dev Biol. 312, 613-622 (2007).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Dev Biol. 311, 623-635 (2007).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata4 regulates the formation of multiple organs. Development. 132, 4005-4014 (2005).
- Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. GATA factors in Drosophila heart and blood cell development. Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).
