Summary
Gen fonksiyonu, başka bir gen tarafından tazminat varsa, fonksiyon kaybı-deneylerde gizlenmiş olabilir. Zebrafish modeli canlı embriyolarının gibi fonksiyonel fazlalık ortaya çıkarmak için nispeten yüksek bir verimlilik anlamına gelir sağlar.
Abstract
Embriyogenez sırasında Gen fonksiyonu genellikle fare hedef mutagenez (nakavt), örneğin, fonksiyon kaybı-deneyleri ile tanımlanır. Zebra balığı modeli gen-spesifik antisens morpholinos mikroenjeksiyon kullanarak, etkili ters genetik teknikler geliştirilmiştir. Morpholinos embriyogenez (demonte) inhibe çeviri sırasında birkaç gün ya da ekleme, geçici olarak belirli bir baz eşleşme ve blok gen fonksiyonu ile bir mRNA'nın hedef. Ancak, fare ya da Zebra balığı gibi omurgalıların, bazı genlerin fonksiyonlarının kaybı telafi başka bir genin varlığı nedeniyle bu yaklaşımlar tarafından gizlenmiş olabilir. Bu, aynı gelişmekte olan dokularda ifade edilir kızkardeşi genleri içeren gen aileler için özellikle doğrudur. Zebra balığı, fonksiyonel tazminat morpholinos co-enjeksiyon, nispeten yüksek verimli bir şekilde test edilebilir, bu genlerin aynı anda hedef demonte. Aynı şekilde, morpholinos kullanarak, herhangi iki gen arasındaki genetik bir etkileşim alt-eşik seviyelerinde birlikte, hem genler demonte tarafından ortaya olabilir. Örneğin, morpholinos ne bireysel demonte bir fenotip oluşturduğu gibi titre edilebilir. Bu koşullar altında, hem de morpholinos ko-enjeksiyon bir fenotipe neden varsa, genetik bir etkileşim göstermiştir. Burada birbiriyle ilişkili iki GATA transkripsiyon faktörleri bağlamında nasıl göstermek için fonksiyonel fazlalık göstermektedir. GATA faktörler kalp atalarıdır tanımlanması için gerekli olan, ancak bu sadece Gata5 ve Gata6 kaybı ortaya çıkar. Biz, mikroenjeksiyon deneyleri yürütmek, morpholinos doğrulamak ve cardiogenesis için telafi fenotip değerlendirmek nasıl göstermektedir.
Protocol
Buradaki amacımız, kardiyomiyosit atalarıdır belirtimi için iki transkripsiyon faktörleri fonksiyonel fazlalık test etmektir. Faktörlerin birbiriyle ilişkili iki gata5 ve gata6 genler tarafından kodlanan ve onların göreceli fonksiyonları 1 anlamak için zebrafish bir model kullanılarak . Bizim stratejimiz, gen fonksiyonu morpholinos 2 kullanarak engellemek için . Biz morpholinos bir ya da diğer gen döllenmiş yumurta içine enjekte ve embriyonik fenotip hem morpholinos ile eş zamanlı olarak enjekte yumurta elde edilen embriyolar ile karşılaştırmak. Fenotipleri değerlendirilmesi basitleştirmek için, biz kardiyomiyositlerde GFP ifade transgen taşıyan balıktan elde edilen yumurta kullanın.
1. Adım. Mikroenjeksiyon için hazırlanması.
A) ayarlama balık üreyen
Enjeksiyonu önce akşam, tek tek erkek ve kadın yetişkin balık (yaş 3-18 ay) çift ertesi sabaha kadar bölme ile ayrılmış damızlık tanklarının içine yerleştirilir. Biz genellikle 10-20 çift balık kurdu, ve ne olursa olsun, yumurta mı, resmi olarak bu fekondite korumak için haftada bir kez evlendirilen vardır. Ayırt kardiyomiyositlerde tanımlamak için basit bir okuma sağladığından, egfp: Bu deneme için cmlc2 için, transgenik bir muhabir gerginlik kullanıyorsunuz. Ertesi sabah, bir kez ışıklar, su getirilir ve bölücüler tankları, balık çiftleri yumurta arkadaşı ve üretmek için izin çekti. Yumurta üretimi izlenecek ve hemen başlatabilir, ya da balık bağlı olarak, bir saat ya da daha fazla bir süre sonra. Tipik olarak, yaklaşık 20 dakika kesintisiz çiftleşme sonra, yumurta, bir pipet veya süzgeç kullanarak toplanmış ve sistem su içeren 100 mm Petri kutularına dökülür. Embriyolar 1-4 hücreli aşamasında arasında enjekte edilir sağlamak için yumurta üretim izlemek için önemlidir. Bir seferde birkaç çifti serbest bırakarak, yumurta üretimi sersemleme ve böylece erken bir gelişim aşamasında enjekte edilebilir yumurta miktarı maksimize etmek mümkündür. Iyi bir çift balık 200'den fazla embriyolar üretmek, ve 4 hücreli aşama ötesine gelişmeden önce tek bir araştırmacı, onları yeterince hızlı enjekte etmek mümkün olmaz çünkü, aynı anda binlerce yumurta toplamak için pratik mantıklı . Balık ışık döngüsü üremek için uyarılırlar, bu nedenle bu bir erken başlamak gerekir, ve yumurta genellikle öğleden sonra elde edilmemiş bir deney.
B) iğneler hazırlanması
- Aşağıdaki koşul kullanarak iki iğne oluşturmak için bir Mikropipet Çektirme ve 3.5 "cam kapiller tüp kullanın: Isı = 626, = 60, Hız = 60, ve Zaman = 250 çekin Biz açık bir filament içermeyen çekirdek iğneler kullanmayın, çünkü. Emme ile ön doldurun.
- Her iğne ucu yavaşça temiz bir jilet veya forseps kullanılarak kırık, ve daha sonra EG-4 mikro-taşlama kullanarak yaklaşık 20 saniye boyunca 30 derece açılı bir eğimli. Bu ucu keskinleştirir ve koryon yoluyla enjekte önemlidir.
- Tutarlı bir iğne çapı yaklaşık 15 mikron ucu boyutu (1-2 nl enjeksiyon hacmi kalibre etmek mümkün ızgara mikroskop mercek kullanarak 4 adet olarak kalibre) elde etmek için önemlidir.
- İğneler, önceden hazırlanmış, güvenli bir yerde güvenli bir şekilde saklanır ve her biri ayrı ayrı tutarlı enjeksiyon hacmi (Ayrıntılar için bölüm D'ye bakınız) sağlamak için enjeksiyonlar başlamadan hemen önce kalibre edilmelidir. Eğer şanslı iseniz, bütün bir deney için tek bir iğne kullanmak mümkün olabilir. Ancak, bir iğne, bir denemenin ortasında kolayca kırılmasına neden olabilir ve o zaman yeni bir iğne çekmek için kullanmak istemiyorum.
C) enjeksiyonu plakaları yapma
- Mikrodalga fırında kaynatarak, 100 ml sistem su içinde% 2 agaroz çözüm hazırlayın.
- Dokunmak serin ve yaklaşık 12ml 100mm bir Petri kabı ters kapağının içine dökün.
- Kapağın her iki tarafın içine, yaklaşık 45 derecelik bir açıda eğik 2 mikroskop slaytlar, yerleştirin. Agaroz katılaşmış sonra, yavaşça kapağı uzak iki slayt çekin.
- Bu embriyoların yerleştiği ve daha sonra enjekte edilecektir olukları oluşturur. Çoklu plakaları önceden hazırlanmış olabilir. % 70 etanol bir katman daha ekleyerek sonra 4 ° C'de orijinal plaka alt ekleyerek ve parafilm mühürleme süresiz olarak saklanabilir. Kullanmadan önce iyice yıkamayı unutmayın.
D) Mikroenjeksiyon istasyonu ve iğne kalibrasyon
- Sıkıştırılmış azot kaynağı ve PLI-100 mikroenjektör açın. Enjektör 18 PSI sabit bir akış basınç için ayarlanabilir olmalıdır.
- Bir iğne takmadan önce, mikromanipülatör geniş bir hareket yelpazesi sağlamak için uygun bir pozisyonda olduğunu temin ve eklenen bir iğne tablo grev olmayacak. Birini takıniğneler sıkı bir mühür olduğundan emin mikromanipülatör içine önceden hazırlanmış (C bölümü). Iğne kırmak için değil dikkatli olun.
- Kalibrasyon geçmeden önce tıkalı değildir emin olmak için mikroskop altında iğne ucu dikkat edin.
- Enjeksiyon çözüm veya GKD 2 O bir damla (2-3 ul) parafilm küçük bir parçasının üzerine koyun ve dolgu düğmesini kullanarak iğne içine çekerek yaklaşık 1,5 ul doldurmak. Eğer iğne ucu tam çözüm var ve herhangi bir hava kabarcığı çizmekten kaçınmak için mikroskop aracılığıyla sıvı emme gözlemlemek emin olun.
- Mineral yağ bir damla bir mikrometre ızgara üzerine yerleştirin.
- Damla boyutu, çapı yaklaşık 1.5 mikron olduğundan emin olmak için enjeksiyon zaman ampirik olarak ayarlayın. Bu ~ 1,8 nl bir enjeksiyon hacmi sunacak. Gerçek ses seçimi için ayarlanmış, ancak pratik bir anlamda doğru 1 nl altında hacimleri kalibre etmek zordur ve embriyoların 2 nl yukarıda birimleri tahammül olmayabilir. Birim boyutu ne olursa olsun kontrolleri dahil olmak üzere tüm enjeksiyonlar için aynı tutmak, seçmek ve enjekte morfolino miktarı titre çözüm konsantrasyonları (enjeksiyon hacmi oldukça fazla) ayarlamak.
- Iğne ucu boyutları değişecektir yeniden kalibre edilmesi, bir iğne değiştirilir her zaman gereklidir.
2. Adım. Iki farklı genleri hedefleyen morpholinos onaylanması
Morpholinos hedef çeviri başlanması ve böylece protein sentezi ya da uygun mRNA işleme engelleyen bir hedef mRNA sitesi veya ek siteler için tasarlanmıştır. Belirli bir demonte gösteren, aynı fenotip oluşturmak, ilk kez bir gen analiz ederken, biz test etmek için her iki tip morpholinos kullanabilirsiniz. Splice-bloker bir avantajı hedef gen için antikorlar mevcut değilse, özellikle yararlıdır RT-PCR, normal transkript demonte doğrulayabilirsiniz. Gata6 5;: '; 5'-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3 gata5 Splice Site MO dizisi' 5'-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3: Biz tutarlı bir kardiyak fenotipi morpholinos (gata5 5'UTR MO dizisi kullanarak gata5 ve gata6 genlerin nasıl elde edilir gız 'UTR MO sırası: 5'-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3').
- Morpholinos Gene Araçlar, LLC (Philomath OR) elde edilir. Gen Araçları ve destek personeli sorarsanız, o hedef için en iyi dizisi seçmenize yardımcı olacaktır. Sadece onlara üyelik numarasını göndermek için, ve onlar bildirecektir gerekir. Ancak, faaliyet doğrulamak için hazırlıklı olmalıyız neden morfolino çalışacağına dair bir garanti yoktur,. Ayrıca morfolino OpenBiosystems kullanılabilir olup olmadığını kontrol edebilirsiniz. Gene Araçları OpenBiosystems sentezlenmiş morpholinos stokları sağlar. Tekrar işe yarayacak hiçbir garanti olsa da, bu test etmek için yeni hedefler karşılamak maliyetlerini düşürmeye yardımcı olabilir, düşük bir maliyetle daha küçük miktarlarda satmak. Transcriptome karşı morfolino BLAST emin olun; UCSC zebrafish genom tarayıcı (genome.ucsc.edu) Blat özelliğini kullanabilirsiniz. Tabii ki, bir morfolino edebiyat (titizlikle) onaylanmıştır varsa, aynı sırayla satın almalarını tavsiye edilir.
- Morfolino steril GKD 2 0 1 mM nihai konsantrasyonu çözülür ve oda sıcaklığında saklanır. Düşük sıcaklıklarda bazen agrega ve çökelmesine neden olabilir bazı nedenlerden dolayı, morfolino çözümleri FREEZE VERMEYİN. Morpholinos, proteazlar veya nükleazlar duyarsız sürece eklediğiniz su steril olarak, oda sıcaklığında oldukça güvenli olmalıdır.
- Enjekte önce, 65 morfolino inkübe ° C sağlamak için 5 dakika tamamen çözünmüş ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Buz üzerinde örnek KOYMAYIN. Morfolino enjeksiyon kadar oda sıcaklığında tutun.
- Morfolino titre için, biz genellikle, 1 mM çalışma konsantrasyonlarda verim 2 0 GKD stok konsantrasyonu 0.5 mM, 0.25 mM ve 0.125mM seri dilüsyonları hazırlar. Enjeksiyon hacmi 1.8 nl kullanarak, sıra bağlı olarak, bu yaklaşık 20ng, 10ng, 5NG, enjeksiyon başına morfolino 2.5ng temsil eder. Bu hoşgörü ve etkinliği her morfolino değişecektir bu yana, sadece bir başlangıç noktasıdır ve tahmin edilemez. En morpholinos çok 20 ng yukarıda tolere edilebilir, ancak bazı 1 ng çok altında dozlarda etkili olabilir. Bizim yaklaşımımız, bir fenotip "yaylalar" konsantrasyonunu tanımlamak için. Diğer bir deyişle, tanımlanmış bir fenotip 2.5 ng kullanarak, ancak 5 ng veya üzerinde herhangi bir miktarda kullanarak benzer ise, bir eşik miktar olarak 5 ng seçsin. Tabii ki, bu "sınır" hakkı yerine daha tekrarlanabilir eşik ötesine çalıştığından emin olmak için, 2.5 ng ve 5.0 ng arasında gelecek titre yararlı olabilir.
- Ekli ve kalibre edilmiş bir iğne doldurun(Bkz. yukarıda) en düşük çalışma konsantrasyonu (en seyreltik) morfolino çözüm. Sadece atık malzeme olarak kaçının, iğne aşırı doldurma. Ul sadece 1 doldurursanız, 500 enjeksiyon için yeterli bir çözüm yoktur.
- Bir pipet kullanarak, mikroenjeksiyon plaka olukları döllenmiş tek hücreli embriyo transferi. Embriyoların enjeksiyon olukları altına düştüğü sağlamak için aşırı su çıkarın. Onlar float değil, agaroz yatağa bağlı olmamalıdır.
- Mikromanipülatör koryon ve enjeksiyon için yumurta sarısı içine iğne ucu inmeye böylece enjeksiyon plakası yerleştirin. Bireysel embriyoları yerleştirmek için, bir iğne ucu iter veya embriyoların uygun konuma çeker enjeksiyon plakası gibi işleyebilirsiniz. Iğne ucu veya hasar embriyolar kırmak için değil, dikkatli olun! Bu biraz pratik alır, ama bir kural olarak, oldukça hızlı ve temiz, enjeksiyondan sonra sonra embriyonun içine bir iğne taşımak ve sadece mikromanipülatör kullanımı. Embriyolar (sol el sağ eli ile enjekte) plaka hareket serbest el kullanarak enjeksiyon konuma getirilir. Yeni bir öğrenci için, enjekte çözüm görselleştirmek için% 0.25 fenol kırmızısı içeren bir solüsyon kullanarak uygulama yararlıdır. Onaylamak için, bu çözüm arası koryon alanından daha ziyade, embriyo enjekte edildi. Güven, aynı zamanda bir çözüm içeren floresan etiketli mikroküreler (F-8794 Molecular Probes) enjekte edilerek elde edilir Ancak, uygulamada bir kaç tur sonra bu yardımları artık gereklidir. Sadece iğne tıkanmış ve enjekte edilen hacim uygun göründüğünü olmadığını teyit etmek için zaman zaman havaya enjekte etmek iyi bir fikirdir.
- Enjekte embriyolar sistem su ile 100mm Petri kabı geri aktarılır ve 28.5C kültüre. En düşük çalışma konsantrasyonu enjeksiyondan sonra, kalan tüm çözüm sınırdışı ve morfolino sonraki en yüksek çalışma konsantrasyonu iğne doldurmak için kullanılan olabilir. Morfolino her konsantrasyon için tekrarlayın. Iğne su kullanarak yıkayın mümkün olsa da, ayrı bir morfolino test ederken, biz iğne değiştirmek ve yeniden kalibre etmek için tercih. Uninjected embriyolar özel parti embriyoların sağlıklı ve normal olup olmadığını doğrulamak için bir kohort tutmak için emin olun.
Adım 3. Bireysel eşik dozlarda morpholinos ko-enjeksiyon
Yukarıda yapılan titrasyon amaç için bir eşik dozu her morfolino tanımlamak için oldu. Hedeflenen gen önemli bir işlevi varsa, en iyi senaryo morphants aslında% 100, tanımlanmış bir fenotip gösterecektir. Ancak, yanlış enjeksiyon eserler bazı değişkenliği nedeniyle bekleyebilirsiniz. Uygulama ile, bu% 10 geçmemelidir. Bazı partiler embriyolar (uninjected kontroller dahil) deney indirimli gerekebilir, bu durumda hayatta değil. Bu arada bireysel embriyolar daha az ya da demonte toleranslı olabilir, biyolojik değişkenlik de vardır. Son olarak, bazı morpholinos sağlam bir demonte (penetrant) elde etmek için yeterince verimli olmayabilir. Bir fenotip embriyo düşük bir yüzde, ama tekrarlanabilir ise, bu ayrı bir morfolino test değer olabilir. Bu sonraki deneyde amaç, hem de genler aynı anda hedeflenen tamamen yeni bir fenotip görülmektedir olup olmadığını belirlemek için. Biz sadece bireysel genler birini test ederken eşik seviyesinde veya üstünde değil ayrı bir fenotip nesil için oldukça morphant fenotip embriyoların yüzde bir artış için, ama değildir.
- , Tanımlanmış bir fenotip oluşturan her bireyin morfolino eşik konsantrasyon, daha önce test morpholinos arada bir karışım hazırlayın. Örneğin, her gen için eşik 5 ng ise, her 5 ng + 5 ng (10 ng toplam) içerecek bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Embriyolar 20 ng toplam morfolino çok daha fazla tahammül edemez bu yana, her gen verimli her hedef için yeterli az miktarda kullanmak için, önceki deneylere göre, önemlidir.
- Kontroller kombinasyonu için kullanılan aynı konsantrasyonda, her bireyin morfolino tek başına enjekte edilen embriyoların setleri içermelidir. Enjeksiyonluk çözelti hacimleri (örneğin 1.8 nl) sabit tutulmalıdır. Bildirici zorlanma kullanarak büyük bir avantajı, herhangi bir zamanda tekrar tekrar fenotip (örneğin kardiyomiyosit farklılaşma) değerlendirmek ve bu. Embriyoların in situ hibridizasyon, gen ekspresyonu için değerlendirilmek üzere iseniz, sahne uyumlu embriyoların ve kontrolleri, çeşitli zamanlarda enjeksiyon sonrası sabit olabilir. Deneme için, yaklaşık 24 hpf, GFP ifade kardiyomiyosit farklılaşması için bir vekil olarak değerlendirmek için devam etmektedir.
Adım 4. Efenotiplerin değerleme
- Enjeksiyondan hemen sonra, enjekte embriyolar izlenir olmalı ve bu kalan morphants canlılığı tehlikeye düşürebilecek gün boyunca birkaç kez, herhangi bir ölü ya da ölmek üzere olan embriyolar kaldırmak için. Muhabir gen ekspresyonu değerlendirmek için, embriyolar floresan kapasite ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak incelenir. 0,75 x 11.25x için bir büyütme 1X veya 1.6x objektif ve bir dizi ile, Nikon SMZ1500 mikroskop kullanıyoruz. Floresan filtre kullanılarak, ışık şiddeti en üst düzeye çıkarmak için tamamen açık ayarı diyafram açmak için emin olun. Ayrıca muhabir gen (GFP, TTT, vs.) Bağlı olarak, doğru bir filtre kullandığınızdan emin olun.
- Embriyolar genellikle 1 / 20 dilüsyon tricaine methanesulfonate 4mg/ml stok sistemi su kullanarak sedasyon. Hisse senetleri-20C dondurularak saklanır. Alternatif olarak, embriyolar 20x tricaine stok kullanılarak ötenazi olabilir. Koryon hala bile Embriyolar genellikle gösterildi olabilir. Ancak, özellikle eğer fotoğrafı olacak, keskin forseps kullanarak chorions kaldırmak için iyi bir fikir. Embriyolar tricaine çözüm depresyon slaytlar yerleştirerek, ya da daha küçük bir damla% 3 metilselüloz yerleştirilir fotoğrafçılığı için onları hareketsiz sonra görülebilir.
- Tek morphants göre morpholinos kombinasyonu enjekte edilen embriyo fenotipleri uyun. Burada ilkel kalp tüpü GFP ifade desen arıyoruz. Bu muhabir gerginlik GFP kardiyomiyositlerde kalp şartname ve kalp tüpü morfolojilerinden ayrıntılı analiz sağlar cmlc2 organizatörü, üzerinden ifade edilir.
Temsilcisi Sonuçlar
Deneyde önemli biyolojik değişkenlik 3,4 olmasına rağmen, eşik seviyeleri ile enjekte edildiğinde, gata5 ve gata6 tek morphants tekrarlanabilir kalp fenotipleri göstermektedir. Örneğin, gata5 morphants çoğu iki bölgede bulunan GFP ifade ile, bifid kalp üretmek. Kalp atalarıdır kalp tüpü oluşumu sırasında orta hatta sigorta düzgün göç başarısız çünkü bu durum oluşur. Ancak, bazı gata5 morphants arızalı bir kalp tüpü oluşturmak ve az sayıda (% 5) GFP + hücrelerinin miktarında önemli bir azalma vardır. Bu biyolojik değişkenliği yansıtan inanıyorum, ama aynı zamanda morpholinos "boş" bir mutasyon eşdeğer olmadığı gerçeğine bağlı olabilir.
Aynı şekilde, gata6 morphants kardiyak fenotipi gösterir ancak, az sayıda bifid, ısıtır da dahil olmak üzere fenotipleri bir dizi var ve morfolojik olan kalpleri uninjected kontrol embriyoların karşılaştırıldığında rahatsız . Kalp oluşumunun dinamik bir süreç olduğu ve en azından bazı kalp fenotip dolaylı embriyonik morfogenetik kusurlarından kaynaklanıyor olabilir bu yana bu değişkenliği, bir kalp morfogenetik fenotip için alışılmadık bir durum değildir. Ancak daha da önemlisi, hem gata5 ve gata6 morphants kalp morfogenetik kusurları dizi tutarlı ve tekrarlanabilir, ve büyük bir bölümü embriyoların önemli GFP + kardiyomiyositlerde oluşturmak.
Gata5 ve gata6 tek morphants tezat olarak, her iki faktörün tükenmiş embriyolar kardiyomiyositlerde kaybı ile tutarlı GFP ifade tam bir kaybı, göstermektedir. Böylece, her gata5 ve gata6 kalp morfolojilerinden olmayan gereksiz fonksiyonları var, ancak iki genin işlevsel olarak farklılaşmış kardiyomiyositlerde nesil için bir gereklilik gereksizdir. Daha önceki çalışmalar için bir gereklilik kardiyomiyosit şartname 3 düşündüren, aynı zamanda nkx2.5 dahil olmak üzere ilk kardiyomiyosit belirteçleri, bir kaybı gösterdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada anlatılan deney, tek başına ayrı bir fenotip yelpazesi olan her iki morpholinos, kombine ve birlikte ortak enjekte edildi tamamen farklı bir fenotip bulundu. Tabii ki, ilk etapta bu denemeyi yapmak için bir gerekçe gerekiyordu. Biz iki genin, bu durumda kalp şartnamede, bir önceki fonksiyonu için birbirlerini telafi olabilir şüpheli. Bu genler çok ilgili (ve aynı DNA dizilerinin bağlama yeteneğine) ve embriyogenez 5 sırasında desen örtüşen ifade edilir çünkü. Ayrıca, Drosophila genetik deneyler GATA transkripsiyon faktörleri, kalp şartname 6 için gerekli olmalıdır .
Ancak, bu stratejinin genetik etkileşim için daha fonksiyonel fazlalık ya da test etmek için kullanılan olabileceği diğer durumlar vardır. İlk olarak, bir veya iki genler demonte belirgin bir fenotip oluşturmak olmayabilir. Bu durumda, her bir gen için tanımlanmış eşik seviyesi var ve kullanımı morfolino miktarı sınırlı, embriyoların ne kadar iyi tolere edilir ampirik olarak tanımlanmış olacak. Yine test tazminat için gerekçe muhtemelen genler son derece ilgili ve co-ekspresyonu teyit olacaktır. İkincisi, genetik etkileşimler alt eşik miktarları morpholinos kullanarak herhangi bir gen çifti için test edilebilir. Bu strateji, bir fenotip oluşturmak DEĞIL maksimal miktarı her morfolino için kullanılır. Hem morpholinos birleştiren bir fenotipi oluşturur oldukça dolaylı ya da paralel yollar temsil olsa da, bu genetik bir etkileşim için güçlü bir kanıt sağlar. Iki gen, uzlaşmaz bir şekilde (yine dolaylı olabilir) etkileşim halinde, ikinci bir morfolino Üçüncü olarak, ko-enjeksiyon, ilk fenotip kurtarma olabilir. Tanımlanmış sınırı farklı genler hedef kaç olsa da, pratik anlamda bir eşik yanıt için gerekli olan her morfolino miktarına bağlı olarak, muhtemelen 3-4 genler.
Ters genetik kullanarak yeni gen fonksiyonlarını ortaya çıkarmak için bu genel yaklaşım nispeten yüksek verimli olmasına rağmen, morpholinos ilgili uyarılar bir dizi vardır. Morpholinos birleştirerek önce, önemli çaba, bu zaten tamamlanmıştır varsa bireysel reaktifler doğrulamak için gereklidir. Başkalarının üretebilir Herhangi bir tek morfolino çalışmayabilir kapalı hedefleme "artefakt" fenotipleri özellikle yaygın apoptozis aktivasyonu ile ilişkili. Reaktifler ucuz değildir ve her genin iki veya daha fazla morpholinos doğrulamak için gerekli ise, bu yatırımın önemli olabilir.
Bazı noktalar deneysel strateji rehberi.
i) bilinen bir mutant fenotip var mı? Eğer öyleyse, tek bir Pheno kopyalama morfolino yeterli olmalıdır.
ii) bir antikor var mı? Eğer öyleyse, bir çeviri-bloker tercih olabilir, değilse, bir ek-bloker etkili pre-mRNA hedefleri bu belgenin çok önemli olacaktır.
iii) mRNA enjeksiyon morphant kurtarma miyim? Bu işe yararsa, morfolino özgüllük için mükemmel bir kanıt sağlar. Ancak, genellikle enjekte edilen mRNA yanlış hedefleme nedeniyle, iş olmayabilir. Kurtarma da bu hedeflenen gen ekspresyonu üzerinde sıkı mekansal ve zamansal bir kontrol izin verebilir transpozon tabanlı transgenesis kullanarak test olabilir. Her iki durumda da, kurtarma gen morfolino tarafından hedef olmasını sağlamak için önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz bu sunum hazırlama, yardım ettikleri için Evans laboratuvar üyeleri teşekkür ediyorum. Burada kullanılan morpholinos başlangıçta Dr. Audrey Holtzinger tarafından onaylandı. TE, Ulusal Sağlık Enstitüleri (HL064282 ve HL056182) hibe tarafından desteklenmektedir. Weill Cornell Medical College Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Enstitüsü tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fish breeder tanks and dividers | Aquatic Habitats | ||
| Fish nets | Aquatic Habitats | ||
| System water | 60mg Instant Ocean” per liter dH2O | ||
| 100mm Petri dishes | BD Biosciences | 351029 | |
| Micropipette needle puller | Sutter Instrument Co. | P-97 Flaming/Brown | |
| 3.5" glass capillaries | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Razor blade | Personna Medical Care | 94-120-71 | |
| Micro grinder | Narishige International | EG-4 | |
| Gridded microscope eyepiece | Premiere | MF-02 | |
| Micrometer | WARD’s Natural Science | 94 W 9910 | |
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| Scale | Mettler Toledo | AB54-S/FACT | |
| Disposable weigh dishes | Fisher Scientific | 2-202-B | |
| Conventional microwave | GE Healthcare | ||
| Erlenmeyer flask | Corning | 4980 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552 | |
| Graduated cylinder | Fisher Scientific | 08-572-6D | |
| Automatic pipette man | BrandTech | 2026333 | |
| 70% ethanol wash solution | Tarr | 801VWR | |
| N2 tank | Tech Air | ||
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micromanipulator | Micro Instruments | LTD | |
| Dissecting microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Parafilm | American National Can | PM-992 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | 34155 | |
| gata5 splice site morpholino | Genetools, LLC | 5’-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3’ | |
| gata5 ATG Blocker | Genetools, LLC | 5’-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3’ | |
| gata6 Long Isoform ATG Blocker | Genetools, LLC | 5’-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3’ | |
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Tricaine Methanesulfonate | Argent Labs | MS-222 | |
| Methycellulose | ICN Biomedicals | 155495 | |
| Heat Block | Fisher Scientific | 11-718-4 | |
| Sharp forceps | Dumont | Size 55 | |
| Depression Microslides | VWR international | 48339-009 |
References
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes. Dev Biol. 312, 613-622 (2007).
- Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium. Dev Biol. 311, 623-635 (2007).
- Holtzinger, A., Evans, T. Gata4 regulates the formation of multiple organs. Development. 132, 4005-4014 (2005).
- Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. GATA factors in Drosophila heart and blood cell development. Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).
