Summary
Biz beyin bölümlerinin kesit alma fareler, kaldırma ve kesit beynin yanı sıra immunoperoksidaz boyama, reçine gömme ve ultra ince transcardiac perfüzyon için bir protokol tanımlamaktadır. Bu prosedürlerin tamamlanmasının ardından, ile immunohistokimyasal malzeme transmisyon elektron mikroskobu ile incelenmesi için hazırdır.
Abstract
Transmisyon elektron mikroskobu (TEM), merkezi sinir sistemi, mikroglia, oligodendrocytic astrositik ve nöronal hücre içi bölmeleri (dendrit dendritik omurga, akson, akson terminali, perikaryon) yanı sıra, bunların hücre içi organelleri ve hücre iskeletinin görselleştirmek için son derece yararlı yüksek uzaysal çözünürlük. Olarak sunulan; TEM ile birlikte, ön gömme immünsitokimya birkaç ayırt edici özellikleri ve kimlik kriterleri (örneğin, mikroglia perikarya ve süreçleri, mikroglia özel işaretleyici Iba1 (iyonize kalsiyum bağlama adaptörü molekülü 1 karşı bir antikor kullanarak hücresel elemanların ayrımcılık sağlar burada)), nörotransmitter olarak hücresel elementler içeriği (örneğin, serotonerjik) ve ultrastrüktürel çözünür ve membrana bağlı proteinler lokalizasyonu (örneğin, 5 HT1A ve EphA4 reseptörler) belirlenmesi. Burada, akrolein fiksatörü, beyin bölümlerinin kaldırılması kesit ve kesit beynin yanı sıra immunoperoksidaz-diaminobenzidin (DAB), boyama, reçine gömme ve ultra ince fareler transcardiac perfüzyon için bir protokol açıklar. Ile immunohistokimyasal malzeme bu prosedürlerin tamamlanmasının ardından, TEM ile inceleme için hazırdır. Titizlikle yapılan zaman, bu tekniğin optimal ultrastrüktürel koruma ve immünositokimyasal algılama arasında mükemmel bir denge sağlar.
Protocol
1. Hayvan perfüzyon
- Perfüzyon bir gün önce, hazırlamak:
- 2 L fosfat tamponu (PB 100 mM, pH 7.4) ve 1 L sodyum fosfat tamponlu salin (PBS;% 0.9, 50 mM PB NaCl, pH 7.4) çift distile su. 4 PB PBS ve 1L ° C Mağaza Bu perfüzyon ve öncesi gömme immünsitokimya için kullanılacaktır.
-% 4.0 paraformaldehid 1L (PFA, pH 7.4) fiksatif 6 farelerin perfüzyon sağlayacak bir çözüm. Bu amaçla, ısı davlumbaz altında PB 1 L. 40 g granül paraformaldehid (PFA) tartılır ve 60 ° C'ye ulaştığında PB çözüm dökün Çözümü, 4 oda sıcaklığında (RT) ve mağaza serin PFA tamamen çözülmüş, ° C, açık olduğunda - Perfüzyon gününde, davlumbaz altında% 3,5 akrolein çözüm PB 500 mL hazırlamak. Daha sonra,% 3,5 akrolein ve filtre kağıdı kullanarak% 4.0 PFA çözümler filtresi.
- 27 gauge ½ "iğne ile periton içine fare anestezi için, sodyum pentobarbital (80 mg / kg) enjekte edilir.
- Perfüzyon sırasında, 50 ml PBS, 75 ml, akrolein ve PFA 150 ml sırayla fare dolaşıma geçecek. Peristaltik pompa kurmak için boru, PBS ile doldurun ve bir ucunda 23 gauge ¾ "kelebek iğne düzeltmek Hortumun diğer ucunu perfüzyon çözeltisi (PBS, acrolein veya PFA) içine daldırın. Peristaltik hızını ayarlama 20-25 ml / dk genç ve yetişkin farelerin pompası. perfüzyon boyunca dikkatli bir şekilde tüpün içinde oluşan hava kabarcıkları önlemek.
- Devam etmeden önce, anestezi fare artık böyle bir kuyruk tutam gibi ağrılı uyaranlara yanıt verene kadar bekleyin. Diseksiyonu tepsi hayvan Lay ve bant kullanarak pençeleri düzeltmek. Cımbız ve makas ile deri ve göğüs boşluğunda kalp maruz açın. Beyin iskemi en aza indirmek için, perfüzyon hızla başlatılması gerekir. Sağ atrium küçük makas ile kesilerek açılır ve peristaltik pompa başlatmak. Cımbız ile kalp tutarken, sol ventrikül apeksi içine kelebek iğne takın.
- Çözüm değişen zaman, peristaltik pompa durdurmak için başka bir çözüm tüp transferi ve pompa hemen yeniden başlatın.
- 150 mL PFA zaman geçti, peristaltik pompa durdurun. Kullanarak, küçük bir makas, baş kesti cilt kadar açık ve gözler arasındaki kafatası kırmak. Beyin kolayca çıkarılabilir kadar küçük cımbız, kafatası küçük parçalar halinde kapalı dikkatle çip kullanılması. Beyin az 2 saat 4 Post-düzeltmek ° C PFA. PBS içinde 3 kez 10 dakika yıkayın.
- Hemen bir vibratome kullanarak buz soğutmalı PBS içinde enine beyin (50 mikron kalınlığında kesitler) kesti. Ince bir fırça ile, PBS içeren bir cam şişenin içine immünsitokimya seçilen bölümleri aktarmak. Birkaç yıl öncesine kadar dölveriminin -20 ° C (% 30 etilen glikol ve PBS içinde% 30 gliserol) geri kalan bölümleri saklayın.
2. Ön-gömme immünsitokimya
- Immünhistokimya için, bölümler, cam şişe içinde serbestçe yüzen işlenir. Süreci boyunca, bir dikkatle bölümleri kurumasına izin kaçınmak gerekiyor.
- Birincisi, bir transfer pipet kullanarak PBS çıkarın ve hemen yeni bir çözüm RT 30 dakika süreyle PBS içinde% 0.1 sodyum bor hidrür ile değiştirin.
- PBS 3 kez 10 dakika ile tüm kabarcıklar kaldırarak bölümleri durulayın ve% 0,5 jelatin ve ikincil antikor oluşturulduğu hayvan% 5 normal serum (normal keçi serum içeren PBS engelleyici bir çözüm oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe Iba1-immün mevcut örnek).
- Çözümü engelleme birincil antikor ile 48 saat inkübe edin. Iba1-immün için, tavşan anti-Iba1 antikor (1:1000) kullanın.
- PBS 3 kez 10 dakika bölümleri durulayın ve RT az 2 saat için çözüm engelleme biotin için konjuge sekonder antikor (1:1000) kuluçkaya yatmaktadır.
Iba1-immün için, keçi anti-tavşan IgGs kullanın. - PBS 3 kez 10 dakika bölümleri durulayın ve RT az 1 saat için çözüm engelleme streptavidin horseradish peroksidaz (1:1000) inkübe.
- PBS 10 dakika ile ve bölümleri HCI-tamponlu Tris / tuzlu su ile durulayın (TBS, 50 mM, pH 7.4) 2 kez 10 dakika. Etiketleme göstermek için,% 0.05 DAB ve TBS içinde% 0.01 hidrojen peroksit (taze hazırlanmış solüsyon) bölümleri kuluçkaya yatmaktadır. Boyama, koyu kahverengi (Şekil 1 örneğe bakın), TBS içinde durulayarak reaksiyon dur. Herhangi bir durumda, en fazla 5 dakika sonra reaksiyon sonunda. TBS 10 dakika ve PB 2 kez 10 dakikalık bölümlerde durulayın.
3. Elektron mikroskobu için işleme
- PB içine ince bir fırça kullanarak multiwell kültür plakasına bölümleri aktarın. Dumanlı kaputun altında PB% 1'lik osmiyum tetroksit çözüm hazırlayın. Kültür plaka kuyulardan PB çıkarın ve ince bir fırça ile düz bölümlere yayıldı. RT 30 dakika için% 1 osmiyum hemen batırmayın bölümleri.
- Cam şişe içine bölümleri Transferi, PB 3 kez 10 dakika ile temizleyin, durulayın ve etanol konsantrasyonları artan içine 2 dakikalık daldırma yoluyla kurutmak: 2 kez% 35, 1 kez% 50,% 70,% 80,% 90, ve 95 % 3 kez propilen oksit tarafından% 100 3 kez.
- Durcupan reçine hazırlamak için, tek renk olana kadar A, B bileşeni 20 g, 0.6 g bileşeni C, ve 0.4 g tek bir behere bileşeni D iyice karıştırın, 20 gr bileşen birleştirmek ve ağırlığında bir alüminyum dökün çanak. Gerekirse, reçine blokları, reçine kalıplar gömme ve 48-72 saat süreyle 55 ° C fırında kür içine dökerek hazırlanabilir.
- Propilen oksit ile durulanır ince bir fırça kullanarak, RT gecede Durcupan reçine emprenye propilen oksit ve batırmayın bölümleri çıkarmak.
- Ertesi gün, alüminyum reçine yumuşatmak için 10 dakika boyunca 55 ° C fırında çanak tartmak koydu. Propilen oksit, mont ince bir tabaka reçine ile bir ACLAR gömme filmi ile durulanır bir fırça kullanarak, başka bir gömme film ile kaplar ve eşit olarak (örneğin cam şişe, plastik kapaklar g yaklaşık 2) hafif ağırlıklarla dağıtmak, bölümler uzandı üstüne reçine yayılmasına yardım. Reçine polimerizasyon için, 48-72 saat (55 ° C) fırında kuluçkaya yatmaktadır.
- Polimerizasyon sonra, bölümleri üst üste hafif ağırlıklarla ve gömme filmi çıkarın. Binoküler mikroskop altında (2x2 mm) kare ilgi alanları seçin ve bunları dikkatli bir şekilde tüketim jilet kullanarak film.
- Tutkal superglue kullanarak reçine blokları ucunda ilgi alanları ve 55 ° C fırında 1 saat süreyle kür.
- Kesit hazırlık, bir jilet ile bir ikizkenar yamuk şeklindeki reçine blok kırpın.
- Ultramicrotome ve bir bardak bıçak kullanarak, doku yüzeyine tutkal ve reçine çıkarmak. Cam bıçak tekne çift distile su ile doldurun ve bir kaç yarı ince kesitler (0.5-1 mikron kalınlığında) kesmek.
- Mükemmel bir döngü ile bir SuperFrost slayt bölümleri aktarın. 1 dakika için 80 ° C ısıtma plakası üzerinde slayt koyarak bölümlerde kurulayın. 1 dakika boyunca% 0.1 toluidin mavi leke (2 g sodyum borat ve 200 ml çift distile su ile 0.2 g toluidin mavi) birkaç damla ile kaplayın. Çift distile su ile boya aşan durulayın. Bölümlerde ışık mikroskobu ile incelenmesi reçine (Şekil 2) lekeli doku ayırt etmek sağlayacaktır.
- Doku ve reçine arasındaki sınır bölümden orta ulaşana kadar kesme sürdürün. Aşağıdaki yordamı eğitim gerektirir unutmayın. Elmas bıçak ile bıçak cam değiştirin ve tekne çift distile su ile doldurun. Gümüş-altın ultra ince bölümler (60-80 nm kalınlığında) gümüş kesin ve ince ters cımbız kullanarak bakır örgü ızgaralar üzerinde dikkatle onları toplamak. Kuru bir filtre kağıdı üzerinde ızgaraları.
- Kontrastı arttırmak için, ultra ince kesitler kurşun sitrat (0,03 g kurşun sitrat ve 0,1 ml 10N sodyum hidroksit 10 ml çift distile su 1) ile boyandı. Ince ters cımbız kullanarak, 2 dakika boyunca kurşun sitrat bir damla için bir kılavuz aktarın. Izgara çıkarın ve ince, çift distile su ile art arda 3 hamam ile durulayın. Son olarak, bir filtre kağıdı üzerinde ızgaraları kuru ve elektron mikroskopik inceleme (Şekil 3-6) kadar bir ızgara kutusunda saklayın.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1 ışık mikroskobu düzeyinde Iba1 lekeli bölümü. Iba1 hücresel dağılımı immün özgüllüğü gösterir mikroglia, sınırlıdır. Ölçeği bar = 100 mikron.
Şekil 2 ışık mikroskobik düzeyde. Toluidine mavi boyanan yarı ince kesit. Immün elektron mikroskobu en yoğun görünecektir doku ve reçine arasındaki sınır unutmayın.
Elektron mikroskobik düzeyde Iba1 immünopozitif mikrogliyal perikaryon ve süreçleri gösteren Şekil 3 Ultrathin bölüm. Iba1 pozitif yapısal elemanların immunoperoksidaz-DAB elektron-yoğun çökelti tarafından kabul edilmektedir. Ölçek çubuğu = 2 mm.
Elektron mikroskobik düzeyde farklı ebat ve şekillerde Iba1 immünopozitif mikrogliyal süreçleri gösteren Şekil 4 Ultrathin bölüm. Ölçek çubuğu = 2 mm.
E 5 "/>
Şekil 5, hücre içi organellerin kimlik sağlayan, yüksek büyütmede Şekil 4 Iba1 pozitif mikrogliyal süreci gösteren Ultrathin bölüm. Ölçek çubuğu = 1 mm.
Şekil 6 Ultrathin bölümünde yüksek büyütmede ultrastrüktürel bir Iba1 pozitif mikrogliyal süreci ve sinapsların da dahil olmak üzere neuropil Yakın unsurları arasındaki ilişkileri ortaya çıkaran . Ölçeği bar = 1 mikrona kadar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, en iyi ultrastrüktürel korunması ve prosedürleri titizlikle yapılmaktadır immünositokimyasal algılama arasında mükemmel bir denge sağlar immunoelectron mikroskopi için fare beyin doku hazırlanması için bir protokol tanımlanmıştır.
TEM ile birlikte, bu yöntem, birkaç ayırt edici özellikleri ve kimlik kriterleri ile hücresel öğeleri ayırt etmek sağlar. Özellikle, Iba1 immunoperoksidaz-DAB boyama neuropil içinde mikroglia perikarya ve süreçleri tanımlamak için, yanı sıra, morfoloji, hücre içi organelleri ve diğer hücre elemanları (Şekil 3-6) ile ultrastrüktürel ilişkiler analiz sağlar. Ayrıca, bu protokol ultrastrüktürel glial ve nöronal elementler çözünür veya membrana bağlı proteinler yerleri yanı sıra hücre içi organelleri ile ilişkisi analiz sağlar. Gerçekten de, spesifik antikorların bu protokolü kullanarak, daha önce 5-HT1A ve nöronal perikarya, dendritler, dendritik dikenler, miyelinsiz aksonlar ve yetişkin sıçan rafe dorsalis nükleus, substantia endotel hücreleri 5-HT1B serotonerjik reseptörleri ultrastrüktürel lokalizasyonu ortaya koymuştur nigra, globus pallidus ve hipokampus 2. Ayrıca postnatal gelişim ve yetişkinlik 3,4,5,6 sırasında, clathrin kaplı vezikül ve fare ve sıçan hipokampus ve serebral korteksin farklı astrositik ve nöronal elementler EphA4 ve EphB2 tirozin kinaz reseptörleri ultrastrüktürel yerelleştirme göstermiştir . Son olarak, bu protokol ön gömme örneğin, yetişkin fare serebral korteks 6 akson terminalleri Vglut1 glutamaterjik taşıyıcı ve EphA4 reseptör eş-lokalizasyon ultrastrüktürel, aynı anda etiketli iki proteinler arasındaki ilişkileri analiz etmek için immunogold ile kombine edilebilir . Bu nedenle, bu tekniğin başarılı bir şekilde sağlık ve hastalık, doğum sonrası hayatı boyunca, çeşitli proteinlerin ultrastrüktürel analizi için, merkezi sinir sistemi farklı bölgelerinde ve hücre tipleri içinde, tek başına ya da immunogold etiketleme ile birlikte uygulanan olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz, teknik yardım için Rochester Tıp Merkezi Üniversitesi'nden Elektron Mikroskobu Araştırma Core Tesisleri'nde bir peristaltik pompa ve vibratome kullanımının yanı sıra, Karen L. Bentley ve Gayle Schneider Shao-Ming Lu ve Harris A. Gelbard teşekkür ederim. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, (EY019277), Whitehall Vakfı, Burroughs Wellcome Fonu ve AKM için Alfred P. Sloan Vakfı hibe tarafından finanse edildi. M.-È.T. Viyana de la recherche tr santé du Québec (FRSQ) doktora sonrası eğitim ödülü tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital (Nembutal) | OVATION Pharmaceuticals | ||
| Filter paper 315 24 cm | VWR international | 28331-081 | |
| *Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich | 01680 | |
| Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich | 452173 | |
| *Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| *Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive |
| Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich | 82325 | |
| Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher Scientific | 01-291-10 | |
| Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher Scientific | NC9261784 | |
| Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | |
| Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich | 44581 | |
| Gelatin subbed slides | VWR international | 100241-864 | |
| ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Capsule mold | Electron Microscopy Sciences | 70150 | |
| High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | |
| Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | |
| Superfrost slides | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | ||
| Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich | G7765 | |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly. |
|||
References
- Venable, J. H., Coggeshall, R. A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy. J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).
- Riad, M. Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain. J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).
- Tremblay, M. E. Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus. J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).
- Tremblay, M. E. Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus. J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).
- Bouvier, D. Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain. J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).
- Bouvier, D. EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain. J Neurochem. , (2010).
