Summary
我々は経心臓的マウスの灌流、脳の除去と切片だけでなく、免疫ペルオキシダーゼ染色、樹脂の埋め込み、および脳切片の切片極薄のためのプロトコルについて説明します。これらの手順が完了すると、免疫染色の材料は、透過型電子顕微鏡による検査のための準備ができています。
Abstract
透過型電子顕微鏡（TEM）がで中枢神経系では、非常に、ミクログリア可視化に有用なオリゴデンドロサイト、アストロサイト、神経細胞内コンパートメント（樹状突起、樹状突起スパイン、軸索、軸索ターミナル、周核体）、ならびにそれらの細胞内小器官と細胞骨格です。高空間分解能。として提示さ、TEMと組み合わせることで、事前に埋め込み免疫細胞は、いくつかの特徴と識別基準（例えば、ミクログリアperikaryonの複数形やプロセス、ミクログリア特異的なマーカーIba1（イオン化カルシウム結合アダプター分子1に対して抗体を使用しているときに携帯電話の要素の識別を可能にここで））、神経伝達物質の細胞内要素の内容（例えば、セロトニン作動性）およびそれらの超微細構造の可溶性または膜結合タンパク質の局在化（例えば、5 HT1AおよびEphA4の受容体を）特定する。ここでは、アクロレイン固定液、脳の除去と切片だけでなく、免疫ペルオキシダーゼ - ジアミノベンジジン（DAB）染色、樹脂の埋め込み、および脳切片の切片極薄でマウスの経心臓的灌流のためのプロトコルについて説明します。これらの手順が完了すると、免疫染色の材料はTEMで試験の準備ができています。厳密に実行する場合は、この手法は、最適な微細構造の保全と免疫細胞化学的検出の間で優れた妥協点を提供します。
Protocol
1。動物の血流
- 灌流の前日に、準備します。
とナトリウムリン酸緩衝液（PBS、50mMのPBで0.9％のNaCl、pH7.4）を生理食塩水を1Lの蒸留水に、 - リン酸緩衝液（100mMの、pH7.4のPB）の2 L。 4でPBのPBSと1L℃にて保存してください。これらは血流との事前エンベディング免疫細胞化学のために使用されます。
- 6匹のマウスの灌流を可能とする4.0％のパラホルムアルデヒド（PFA、pH7.4）で固定液の1L。その目的のために、換気フードの下にPBの1 Lを加熱する。粒状パラホルムアルデヒド（PFA）の40gを秤量し、60℃に達すると、PB溶液中に注ぐこのソリューションは、完全に溶解PFAで、4℃、室温（RT）とストアへのクールなクリアされている場合℃の - 血流の日に、換気フードの下にPBで3.5％アクロレイン溶液500mlを用意。その後、3.5％アクロレインとろ紙を用いて4.0％PFAのソリューションをフィルタリング。
- マウスの麻酔の場合は、27ゲージで腹膜にペントバルビタールナトリウム（80 mg / kg）を注入する½"針を。
- 灌流時には、PBSを50mLのは、アクロレインの75 mLを加え、PFAの150mLのは、順番にマウスの循環に渡されます。蠕動ポンプを設定するには、PBSでチューブを記入し、一方の端に23ゲージ¾"蝶の針を固定する。灌流液（PBS、アクロレインまたはPFA）にチューブのもう一方の端を浸す。蠕動の速度を設定します。幼若および成熟マウス20〜25 mL / minのポンプ。灌流を通して、チューブ内に形成する空気の気泡を慎重に避ける。
- 麻酔マウスは、もはや先に進む前に、そのような尾のピンチのような痛み刺激に応答するまで待って。解剖トレイに動物を置き、テープを使用して足を固定する。ピンセットやハサミで、肌と心を公開するために胸腔を開く。脳虚血を最小限に抑えるために、血流は急速に起動する必要があります。小さなハサミで右心房を開いてカットし、蠕動ポンプを起動します。ピンセットで心臓を押さえながら、左心室の頂部に蝶の針を挿入する。
- ソリューションを変更する場合は、蠕動ポンプを停止し、つのソリューションから別のチューブに移し、ポンプを直ちに再起動します。
- PFAの150mLのが経過すると、蠕動ポンプを停止する。小さなはさみを使って、肌を開く、頭を切り落とし、と目の間に頭蓋骨を破る。脳は簡単に削除できるようになるまで頭蓋骨の小さい部分から慎重にチップ、小さなピンセットを、使用する。 4℃で2時間脳をポスト修正° PFAのC。 PBSで3回10分を洗浄する。
- すぐにビブラトームを用いて氷冷PBSで横の脳（50μm厚のセクション）をカット。細かいブラシで、PBSを含有するガラスバイアルに免疫細胞化学用に選択されたセクションを転送する。数年までのために凍結防止剤で、-20 ° C（30％エチレングリコール及びPBSで30％グリセロール）で残りのセクションを保管してください。
2。プレ埋め込み免疫細胞化学
- 免疫細胞の場合、セクションは、ガラスバイアルに浮かんで自由に処理されます。手順では、人は慎重にセクションが乾燥させることを回避する必要があります。
- 最初に、転送ピペットを用いてPBSを除去し、すぐに室温で30分間、PBS中の0.1％の水素化ホウ素ナトリウムの新鮮な溶液を交換してください。
- 、PBSで3回10分でセクションをすすぎ、すべての気泡を除去し、0.5％ゼラチンおよび二次抗体が生成された動物の5％正常血清（正常ヤギ血清中の含有PBSブロッキング液に室温で2時間インキュベートIba1 -免疫染色の現在の例）。
- ブロッキング溶液に一次抗体で48時間インキュベートする。 Iba1 -免疫染色のために、ウサギ抗Iba1抗体（1:1000）を使用してください。
- PBSで3回の10分のセクションをすすぎ、室温で2時間ブロッキング溶液でビオチンへの結合二次抗体（1:1000）でインキュベートする。
Iba1 -免疫染色のために、ヤギ抗ウサギIgGを使用してください。 - PBSで3回の10分のセクションをすすぎ、室温で1時間ブロッキング溶液にストレプトアビジン - 西洋ワサビペルオキシダーゼ（1:1000）でインキュベートする。
- PBSの10分とトリス/塩酸緩衝生理食塩水でセクションをリンス（TBS、50 mMのは、pH 7.4）2回10分。ラベルを明らかにするために、0.05％DABとTBSの0.01％過酸化水素（新たに調製した溶液）を持つセクションをインキュベートする。染色は、暗褐色のとき（図1の例を参照）、TBSで洗浄して反応を停止する。いずれの場合でも、最大5分後に反応を終了させる。 TBSの10分とPB 2回10分でセクションをすすいでください。
3。電子顕微鏡のための処理
- 細かいブラシを使ってマルチウェル培養プレートにPBにセクションを移す。発煙ボンネットの下にPBの1％四酸化オスミウム溶液を調製。培養プレートのウェルからPBを外し、細かいブラシでフラットなセクションを広げる。室温で30分間、1％オスミウムですぐに浸すセクション。
- 、ガラスバイアルにセクションを移しPB 3回10分ですすぎ、およびエタノールの濃度を昇順に2分のはめ込みを通して脱水：2回35％、1回50％、それぞれ、70％、80％、90％、および95 3倍の酸化プロピレン続い％、3回100％。
- Durcupan樹脂を準備するには、色が均一になるまでよく混ぜ、使い捨てビーカーにコンポーネントを20g、成分B、成分Cを0.6g、及び成分Dを0.4gの20gを組み合わせることで、アルミ重量に注ぐ皿。必要に応じて、樹脂ブロックは、金型を埋め込むと、48〜72時間、55℃のオーブンで硬化中に樹脂を注入することにより調製することができる。
- 酸化プロピレンですすぎ細かいブラシを使用して、室温で一晩含浸用Durcupan樹脂に酸化プロピレンと浸すからセクションを削除。
- 翌日、アルミ、樹脂を柔らかくするために10分間55℃のオーブンに皿の重量を量る置く。プロピレンオキサイド、コート樹脂の薄層とACLAR埋め込みフィルムでリンスブラシを使用して、別の埋め込みフィルムでカバーし、均等に（;例えばガラスバイアルのプラスチックキャップをgで約2）光の重みを分散、セクションを下に置く上に樹脂が拡散するのに役立ちます。樹脂の重合のため、48〜72時間のオーブン（55℃）でインキュベートする。
- 重合後、セクションの上部に光の重みと埋め込み膜を除去。双眼顕微鏡下で、関心の正方形の領域を選択（2 × 2 mm程度）とカミソリの刃を使ってフィルムから、それらを注意深く物品。
- スーパー接着剤を使用して、樹脂ブロックの先端に接着剤の関心領域を、1時間、55℃のオーブンで硬化する。
- 切片の準備のために、カミソリの刃と等脚台形の形状に樹脂ブロックをトリム。
- ウルトラミクロトーム、ガラスナイフを使用して、組織の表面に接着剤や樹脂を取り外します。再蒸留水とガラスのナイフのボートを記入し、いくつかの半薄切片を（0.5-1μmの厚さ）カット。
- 完璧なループを持つSuperFrostスライドするセクションを転送する。 ℃で1分間80℃の加熱プレート上にスライドを配置することにより、セクションを乾かします。 1分間0.1％トルイジンブルー染色（2 gのホウ酸ナトリウム、200 mLの蒸留水に0.2グラムトルイジンブルー）を数滴でカバー。再蒸留水で汚れを過剰に洗い流してください。光学顕微鏡によるセクションの試験は、樹脂（図2）から染色した組織を区別できるようになります。
- 組織と樹脂の間に境界線がセクションの真ん中に達するまで切削再開。次の手順では、トレーニングを必要とすることに注意してください。ダイヤモンドナイフでガラスナイフを交換し、再蒸留水で船を埋める。銀金の極薄のセクション（60〜80 nmの厚さ）に銀をカットし、慎重に細かい逆ピンセットを用いて銅メッシュグリッドにそれらを収集する。ろ紙上にグリッドを乾かします。
- コントラストを高めるために、超薄切片をクエン酸鉛（0.03 gのクエン酸鉛と10mLの蒸留水1の0.1mLの10N水酸化ナトリウム）で染色することができます。細かい逆ピンセットを使用して、2分間クエン酸鉛の低下にグリッドを転送する。グリッドを削除し、微妙に二重蒸留水の3回連続お風呂で洗う。最後に、ろ紙上にグリッドを乾燥し、電子顕微鏡検査（図3-6）までのグリッドボックスに格納します。
4。代表的な結果
図1光学顕微鏡レベルでIba1染色セクション。 Iba1の細胞分布を免疫染色の特異性を示すミクログリア、に限定されている。スケールバー= 100μmの。
図2。光学顕微鏡レベルでのトルイジンブルー染色半薄片。免疫染色、電子顕微鏡で最も強烈に表示される組織と樹脂の間に境界線を注意してください。
電子顕微鏡レベルでIba1免疫陽性ミクログリアの周核体とプロセスを示す図3。極薄のセクション。 Iba1陽性構造要素は、それらの免疫ペルオキシダーゼ- DAB電子密度の高い沈殿物によって認識されています。バー= 2μmのスケール。
電子顕微鏡レベルで異なるサイズと形状のIba1免疫陽性ミクログリアのプロセスを表示する図4。極薄のセクション。バー= 2μmのスケール。
E 5"/>
図5。その細胞内小器官の同定を可能にする、より高い倍率で図4からIba1陽性ミクログリアのプロセスを示す薄部。スケールバー= 1μmの。
より高い倍率でIba1陽性ミクログリアのプロセスとシナプスを含む神経網の近くには要素間の超微細構造の関係を明らかにする図6。極薄のセクション。スケールバー=1μmの。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここでは手続きが厳格に実行されるときに、最適な超微細構造の保全と免疫細胞化学的検出の間で優れた妥協点を提供する免疫電子顕微鏡のためのマウスの脳組織の準備のためのプロトコルを記述している。
TEMと組み合わせることで、この方法はいくつかの特徴と識別基準に携帯電話の要素を区別することができます。特に、Iba1の免疫ペルオキシダーゼ- DAB染色では神経網の中で、ミクログリアperikaryonの複数形およびプロセスを識別するだけでなく、その形態、細胞内小器官、および他の細胞要素（図3-6）との超微細構造の関係を分析することができます。さらに、このプロトコルは、超微細構造グリアや神経の要素で可溶性または膜結合タンパク質の位置だけでなく、細胞内小器官との関連を分析することができます。確かに、特異的な抗体で、このプロトコルを使用して、我々はこれまで5 - HT1Aと5 - HT1Bセロトニン作動性神経perikaryonの複数形で受容体、樹状突起、樹状突起、無髄軸索、および成体ラット縫線背核、ドーパミンの内皮細胞の電顕的局在を明らかにした黒質、淡蒼球、および海馬2。我々はまた、生後発達と成人3,4,5,6の間に、クラスリン被覆小胞とマウスとラットの海馬や大脳皮質の異なるアストロサイトとニューロンの要素でEphA4のとEphB2チロシンキナーゼ受容体の電顕的局在を示している。最後に、このプロトコルは、事前に埋め込 むには、例えば、成体マウスの大脳皮質6の軸索末端にVglut1グルタミン酸トランスポーターとEphA4の受容体の共局在を次の2つの同時標識タンパク質との間の超微細構造の関係を分析するために免疫金と組み合わせることができます。したがって、この手法は成功し、健康や病気で、出生後の生活を通して、様々な地域や中枢神経系の細胞型内の様々なタンパク質の微細構造的解析のために、単独で、または免疫金標識との組み合わせで、適用することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は技術支援のためのロチェスター大学医療センターの電子顕微鏡研究の中核施設で、蠕動ポンプとビブラトームの使用だけでなく、カレンL. Bentleyとゲイルシュナイダーのために少明陸とハリスA. Gelbardに感謝。この作品は、NIH（EY019277）、ホワイトホール財団、バローズウェルカム基金、及びAKMのアルフレッドP.スローン財団からの補助金によって賄われていた。 M.-È.T.フォンデラ凝ったエンサンテケベック（FRSQ）ポスドクトレーニングの賞によって運営されている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital (Nembutal) | OVATION Pharmaceuticals | ||
| Filter paper 315 24 cm | VWR international | 28331-081 | |
| *Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich | 01680 | |
| Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich | 452173 | |
| *Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| *Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive |
| Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich | 82325 | |
| Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher Scientific | 01-291-10 | |
| Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher Scientific | NC9261784 | |
| Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | |
| Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich | 44581 | |
| Gelatin subbed slides | VWR international | 100241-864 | |
| ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Capsule mold | Electron Microscopy Sciences | 70150 | |
| High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | |
| Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | |
| Superfrost slides | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | ||
| Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich | G7765 | |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly. |
|||
References
- Venable, J. H., Coggeshall, R. A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy. J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).
- Riad, M. Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain. J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).
- Tremblay, M. E. Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus. J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).
- Tremblay, M. E. Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus. J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).
- Bouvier, D. Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain. J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).
- Bouvier, D. EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain. J Neurochem. , (2010).
