Summary
우리는 두뇌 섹션 sectioning 마우스, 제거 및 sectioning 뇌뿐만 아니라, immunoperoxidase의 얼룩, 수지 포함하고, ultrathin의 transcardiac 재관류에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 절차가 완료되면 immunostained 자료 전송 전자 현미경과 함께 시험에 대한 준비가되었습니다.
Abstract
전송 전자 현미경 (TEM)은에서 중추 신경계에 microglial, oligodendrocytic astrocytic와의 연결을 subcellular 구획 (dendrite, 돌기 척추, 축삭, 축삭 터미널, perikaryon),뿐만 아니라 자신의 세포 organelles과 cytoskeleton을 시각화를위한 매우 유용합니다 높은 공간 해상도. 로 표시, TEM과 결합하여, 사전 퍼가기의 immunocytochemistry는 몇 가지 독특한 기능과 식별 기준 (예, microglial perikarya 및 프로세스, microglia 특정 마커 Iba1 (이온화 칼슘 바인딩 어댑터 분자 하나에 대한 항체를 사용하는 경우와 세포 요소의 차별을 허용 여기에)), 신경 전달 물질의 세포 요소의 내용 (예 : serotonergic) 및 ultrastructural 가용성이나 멤브레인 - 바운드 단백질의 지방화 (예 : 5 HT1A 및 EphA4 수용체)를 식별. 여기, 우리는 acrolein 정착액, 뇌 섹션의 sectioning 제거 및 sectioning 뇌뿐만 아니라 immunoperoxidase - diaminobenzidine (DAB) 얼룩, 수지 포함하고, ultrathin와 생쥐의 transcardiac 재관류에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 절차가 완료되면 immunostained 자료 TEM과 시험 준비가되었습니다. 엄격하게 수행하는 경우,이 기술은 최적의 ultrastructural 보존과 immunocytochemical 검출 사이 좋은 타협을 제공합니다.
Protocol
1. 동물 재관류
- 재관류 전날에 준비 :
- 인산염 버퍼 2 패 (PB, 100 MM, 산도 7.4) 및 나트륨 1 L 인산염 버퍼 호수 (PBS를, 0.9 % 50 MM PB에 NaCl, 산도 7.4)을 두 번 증류수 인치 4 PB의 PBS와 1L ° C.를 저장 이들은 재관류 및 사전 삽입의 immunocytochemistry에 사용됩니다.
- 6 생쥐의 재관류를 가능하게 4.0 %의 paraformaldehyde의 1L (PFA, 산도 7.4) 정착액 솔루션. 그 목적을 위해, 가열 퓸 후드 아래에 PB 1 패 있습니다. 세분화된 paraformaldehyde (PFA)의 40g의 무게를하고 60 ° C.에 도달하면 PB 솔루션에 따르다 솔루션은 4 실온 (RT)과 저장하는 시원한 PFA 완전히 용해, ° C.으로 명확하면 - 재관류의 날, 퓸 후드 아래의 PB에 3.5 %의 acrolein 솔루션 500 ML을 준비합니다. 그런 다음, 3.5 % acrolein와 필터 용지를 사용하여 4.0 % PFA 솔루션을 필터링합니다.
- 마우스 마취 들어, 27 게이지 ½ "바늘과 복막에 (80 MG / kg) 나트륨은 pentobarbital 주입.
- 재관류 동안, PBS 50 ML은 acrolein의 75 ML 및 PFA 150 ML은 순차적으로 마우스 순환에 전달합니다. 연동 펌프를 설정하려면, PBS로 튜브를 기입 한쪽 끝에 23 게이지 어 "나비 바늘을 수정. 재관류 솔루션 (PBS, acrolein 또는 PFA)에 관의 다른 쪽 끝을 담가. 연동의 속도를 설정 20-25 ML / 청소년 및 성인 쥐에 대한 분에 펌프. 재관류 동안 조심스럽게 튜브의 성형 공기의 거품을하지 마십시오.
- anaesthetized 마우스가 더 이상 같은 꼬리 핀치로 통증 자극에 반응하지 않을 때까지 계속 진행하기 전에, 잠깐 만요. 절개 트레이에 동물을 배치하고 테이프를 사용하여 발 수정. 족집게와 가위로, 피부와 마음을 노출 흉강을 엽니다. 뇌 국소 빈혈을 최소화하려면, 재관류가 빠르게 시작되어야합니다. 작은 가위로 오른쪽 아트리움을 열고 잘라 연동 펌프를 시작합니다. 핀셋으로 마음을 잡고 있지만, 좌심실의 꼭대기에 나비 바늘을 삽입합니다.
- 솔루션을 변경하면, 연동 펌프를 중지 해결책이 하나에서 다른 튜브를 전송하고, 즉시 펌프를 다시 시작합니다.
- PFA 150 ML이 통과되면, 연동 펌프를 중지합니다. 작은 가위를 사용하여, 머리를 잘라 껍질을 열고 눈 사이 두개골을 깰. 두뇌가 쉽게 제거할 수있을 때까지 머리 작은 조각에서 신중하게 칩을 작은 핀셋을 사용합니다. 4에서 2 시간 동안 머리를 포스트 수정 ° PFA에서 C. PBS로 3 회 10 분 씻으십시오.
- 즉시 vibratome를 사용하여 얼음 냉각 PBS에서 가로의 두뇌 (50 μm의 두께 부분)을 잘라. 좋은 브러시로 PBS를 포함하는 유리관에 immunocytochemistry에 대해 선택한 섹션을 전송합니다. 몇 년 최대 cryoprotectant에서 -20 ° C (30 % 에틸렌 글리콜과 PBS에 30 % 글리세롤)의 나머지 부분을 저장합니다.
2. 사전 퍼가기의 immunocytochemistry
- immunocytochemistry 들어, 섹션은 자유롭게 유리 튜브에 떠있 처리됩니다. 절차 전반에 걸쳐, 하나주의 깊게 섹션 밖으로 건조시키는 않도록해야합니다.
- 첫째, 전송 피펫을 사용하여 PBS를 제거하고 즉시 RT 30 분 PBS에 0.1 %의 나트륨 borohydride의 새로운 솔루션으로 대체합니다.
- 모든 거품을 제거, PBS 3 회 십분와 섹션을 씻어하고, 0.5 젤라틴 %와 보조 항체가 생성된있는 동물의 5 % 정상 혈청 (정상 염소 혈청에를 포함하는 PBS의 차단 솔루션 RT에서 2 시간 동안 부화 Iba1 - immunostaining의 현재 예).
- 솔루션을 차단의 기본 항체를 48 시간 동안 부화. Iba1 - immunostaining 들어, 토끼 방지 Iba1 항체 (1:1000)를 사용합니다.
- PBS 3 회 십분와 섹션을 씻어 RT에서 2 시간 동안 솔루션을 차단에 비오틴을 복합 이차 항체 (1:1000)에 품어.
Iba1 - immunostaining 들어, 염소 방지 토끼 IgGs를 사용합니다. - PBS 3 회 십분와 섹션을 씻어 RT에서 1 시간 동안 솔루션을 차단에 streptavidin - 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (1:1000)에 품어.
- PBS 십분와 트리스 / HCL - 버퍼 식염수에 섹션 린스 (TBS, 50 MM, 산도 7.4)은 2 번 10 분 거리에 있습니다. 레이블을 표시하려면, 0.05 %의 DAB와 TBS에서 0.01 %의 과산화수소 (신선한 솔루션)와 섹션을 품어. 얼룩이 (그림 1 예 참조) 어두운 갈색 때, TBS에서 rinsing하여 반응을 중지합니다. 어떤 경우에는 5 분 최대 후 반응을 종료합니다. TBS 십분과 PB 2 배 십분와 섹션을 씻어.
3. 전자 현미경에 대한 처리
- 좋은 브러쉬를 사용하여 multiwell 문화 판에서 PB로 섹션을 전송합니다. 발연 후드 아래의 PB에 1 % 오스뮴의 tetroxide 솔루션을 준비합니다. 문화 판의 우물에서 PB를 제거하고 좋은 브러시로 평면 섹션을 확산. RT 30 분 1 % 오스뮴에 즉시 몰두 섹션.
- 유리 튜브에 섹션을 전송, PB 3 회 십분와 린스, 그리고 에탄올의 농도 상승으로 2 분 immersions 통해 탈수 : 2 곱하기 35 %, 1 회 50 % 각각 70 %, 80 %, 90 %, 및 95 %, 3 회 프로필렌 산화물 다음 백퍼센트 3 회.
- Durcupan 수지를 준비하려면, 색상 균일 될 때까지, 구성 요소 B의 20g, 구성 요소 C의 0.6 g, 그리고 일회용 비이커에 구성 요소 D의 0.4 g이 잘 혼합 구성 요소 20g을 결합하고, 무게는 알루미늄에 따르다 요리. 필요한 경우, 수지 블록 금형을 삽입하고 48~72시간을위한 55 ° C 오븐에서 경화에 수지를 따르고으로 준비하실 수 있습니다.
- 프로필렌 산화물과 씻어서 좋은 브러시를 사용하여 RT에서 밤새 함침에 대한 Durcupan 수지로 프로필렌 산화물과 담가에서 섹션을 제거합니다.
- 다음날, 알루미늄은 수지를 약화시키기 위해 10 분 동안 55 ° C 오븐에 요리를 넣어 무게. 프로필렌 산화물, 코팅 수지의 얇은 레이어와 ACLAR 퍼가기 필름과 씻어서 브러쉬를 사용하여 다른 퍼가기 영화로 커버하고, 골고루 (; 예 : 유리 튜브의 플라스틱 뚜껑을 위해 g 약 2) 가벼운 무게를 배포 섹션을 내려 놓 아라 위에 수지가 확산을 도울 것이다. 수지 중합 들어, 48~72시간에 대한 오븐 (55 ° C에서)에서 알을 품다.
- 중합 후 섹션의 상단에 빛이 가중치 및 삽입 필름을 제거합니다. 쌍안경 현미경, 관심있는 사각형 영역을 (2x2 mm 정도)를 선택하고 면도날을 사용하여 영화에서 신중하게 소비세.
- 접착제는 Superglue를 사용하여 수지 블록의 끝에 관심 영역 1 시간 동안 55 ° C 오븐에 치료.
- sectioning 준비에서 면도날과 이등변 사다리꼴의 형태에 수지 블록을 잘라.
- ultramicrotome 및 유리 칼을 사용하여 조직의 표면에서 접착제와 수지를 제거합니다. 더블 증류수와 함께 유리 칼의 보트를 입력하고 몇 반 얇은 섹션 (0.5-1 μm의 두께) 했네요.
- 완벽한 루프와 SuperFrost 슬라이드 섹션을 전송합니다. ° C 1 분 80 열판에 슬라이드를 삽입하여 섹션을 건조. 1 분 0.1 % toluidine 파란색 얼룩 (2g의 나트륨 borate 200 ML 더블 증류수 0.2 g toluidine 파란색)의 몇 방울로 커버. 더블 증류수로 얼룩 초과를 씻어. 가벼운 현미경으로 섹션의 심사는 수지 (그림 2)에서 스테인드 조직을 구별할 수 있도록합니다.
- 조직과 수지의 경계는 부분의 중앙에 도달할 때까지 절단 이력서. 다음 절차는 훈련이 필요합니다. 다이아몬드 칼로 유리 칼을 교체하고 두 번 증류수로 배를 채우십시오. 실버 - 골드 ultrathin 섹션 (60-80 nm의 두께)에 은색을 잘라 조심스럽게 좋은 거꾸로 핀셋을 사용하여 구리 메쉬 그리드에 그들을 수집합니다. 필터 종이에 그리드를 건조시킵니다.
- 콘트라스트를 향상시키기 위해, ultrathin 섹션은 리드 구연 산염 (10 ML 더블 증류수 1 0.03 g 리드 구연 산염 및 0.1 ML 10N 수산화 나트륨) 물들일 수 있습니다. 좋은 거꾸로 핀셋을 사용하여 2 분 동안 리드 구연 산염의 드롭에 격자를 전송합니다. 격자를 제거하고 정교한 이중 증류수 3 연속 목욕탕에서 씻어. 마지막으로, 필터 종이에 그리드를 건조하고 전자 현미경 검사 (그림 3-6)까지 그리드 상자에 저장합니다.
4. 대표 결과
그림 1. 빛의 미세한 수준에서 Iba1 묻은 섹션을 참조하십시오. Iba1의 세포 분포는 immunostaining의 특이성을 보여줍니다 microglia로 제한됩니다. 스케일 바 = 100 μm의.
빛의 미세한 수준에서 그림 2. Toluidine 푸른 스테인드 세미 얇은 섹션을 참조하십시오. immunostaining은 전자 현미경에서 가장 강렬 나타납니다 조직과 수지의 경계를 적어 둡니다.
전자 현미경 수준에서 Iba1 - immunopositive microglial perikaryon 및 프로세스를 보여주는 그림 3. Ultrathin 섹션. Iba1 - 긍정적인 구조 요소들은 immunoperoxidase - DAB 전자 - 밀도 침전물로 인정받고 있습니다. 스케일 바 = 2 μm의.
전자 미세한 수준에서 서로 다른 크기와 모양의 Iba1 - immunopositive microglial 프로세스를 표시하는 그림 4. Ultrathin 섹션. 스케일 바 = 2 μm의.
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그림 5. 그 세포 organelles의 식별을 가능하게 높은 배율의 그림 4에서 Iba1 - 긍정적인 microglial 과정을 보여주는 Ultrathin 섹션. 스케일 바 = 1 μm의.
높은 배율에서 Iba1 - 긍정적인 microglial 프로세스와 시냅스를 포함한 neuropil 주변 요소 사이의 ultrastructural 관계를 드러내는 그림 6. Ultrathin 섹션. 스케일 바 = 1μm.
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Discussion
여기 우리는 최적의 ultrastructural 보존 및 절차 엄격하게 수행됩니다 immunocytochemical 감지, 사이 좋은 타협을 제공 immunoelectron 현미경에 대한 마우스 뇌 조직의 준비를 위해 프로토콜을 설명합니다.
TEM과 결합,이 방법은 몇 가지 독특한 기능과 식별 기준으로 세포 요소를 구분할 수 있습니다. 특히, Iba1의 immunoperoxidase - DAB의 얼룩은 neuropil 내에 microglial perikarya 및 프로세스를 식별하는,뿐만 아니라 형태, 세포 organelles 및 기타 휴대 요소 (그림 3-6)와 ultrastructural 관계를 분석할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 ultrastructural glial이나의 연결 요소에 용해 또는 멤브레인 - 바운드 단백질의 위치뿐만 아니라 세포 organelles 그들의 연관 관계를 분석하실 수 있습니다. 사실, 특정 항체이 프로토콜을 사용하여, 우리는 이전에 5 HT1A와의 연결을 perikarya, dendrites, 돌기 쪽이, unmyelinated axons, 그리고 성인 쥐 raphe 발등 핵, substantia의 내피 세포에서 5 HT1B serotonergic 수용체의 ultrastructural 지방화는 감을 잡을수있다 니그라, globus pallidus의, 그리고 해마 2. 또한 출생 후의 개발 및 성인 3,4,5,6 동안 clathrin - 코팅 vesicles 마우스 및 쥐 해마와 대뇌 피질의 다른 astrocytic와의 연결 요소에 EphA4 및 EphB2 티로신 키나제 수용체의 ultrastructural 지방화를 보이고있다. 마지막으로,이 프로토콜은 미리 삽입 예를 들어, 성인용 마우스 대뇌 피질 6 축삭 터미널에서 Vglut1 glutamatergic 전송 및 EphA4 수용체의 공동 현지화 둘이 동시에 표시된 단백질 사이의 ultrastructural 관계를 분석하는 immunogold과 함께하실 수 있습니다. 따라서,이 기법이 성공적으로 건강 및 질병에, 출생 후의 생활 전반에 걸쳐, 중앙 신경 시스템의 서로 다른 지역 및 세포 유형 내에서 다양한 단백질의 ultrastructural 분석, 혼자 또는 immunogold 라벨와 함께, 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 기술 지원을 위해 로체스터 의료 센터의 대학의 전자 현미경 연구의 핵심 시설에 연동 펌프와 vibratome의 사용뿐만 아니라, 카렌 L. 벤틀리와 게일 슈나이더에 대한 Shao - 명나라 루 해리스 A. Gelbard 감사합니다. 이 작품은 NIH (EY019277), 화이트홀 재단, 버로우즈 웰컴 기금과 AKM에 알프레드 P. 슬로안 재단의 기금에 의해 투자되었다. M.-È.T. 퐁 드 라 공들인 엉 쌍떼 두 퀘벡 (FRSQ) 박사 교육 수상에 의해 후원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital (Nembutal) | OVATION Pharmaceuticals | ||
| Filter paper 315 24 cm | VWR international | 28331-081 | |
| *Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich | 01680 | |
| Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich | 452173 | |
| *Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| *Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive |
| Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich | 82325 | |
| Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher Scientific | 01-291-10 | |
| Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher Scientific | NC9261784 | |
| Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | |
| Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich | 44581 | |
| Gelatin subbed slides | VWR international | 100241-864 | |
| ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Capsule mold | Electron Microscopy Sciences | 70150 | |
| High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | |
| Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | |
| Superfrost slides | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | ||
| Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich | G7765 | |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly. |
|||
References
- Venable, J. H., Coggeshall, R. A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy. J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).
- Riad, M. Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain. J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).
- Tremblay, M. E. Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus. J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).
- Tremblay, M. E. Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus. J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).
- Bouvier, D. Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain. J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).
- Bouvier, D. EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain. J Neurochem. , (2010).
