Summary
Nós descrevemos um protocolo para perfusão intracardíaca de ratos, remoção e corte do cérebro, bem como coloração por imunoperoxidase, a incorporação de resina, seccionamento e ultrafina das seções do cérebro. Após a conclusão desses procedimentos, o material imunocoradas está pronto para exame em microscopia eletrônica de transmissão.
Abstract
Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) é extremamente útil para visualizar microglial, oligodendrocytic, astrocíticos e neuronal compartimentos subcelulares (dendrito, espinha dendrítica, axônio, axônio terminal, pericário), bem como suas organelas e do citoesqueleto intracelular no sistema nervoso central em alta resolução espacial. Combinado com o TEM, pré-incorporação imunocitoquímica permite a discriminação de elementos celulares com poucas características e critérios de identificação (por exemplo, microglial perikarya e processos, quando se utiliza um anticorpo contra o marcador microglia específicos Iba1 (cálcio ionizado molécula adaptador de ligação 1; como apresentado aqui)), identificando o conteúdo do neurotransmissor dos elementos celulares (por exemplo, serotoninérgicos) e sua localização ultra-estrutural de proteínas solúveis ou ligada à membrana (por exemplo, 5 HT1A e EphA4 receptores). Aqui, nós descrevemos um protocolo para perfusão intracardíaca de camundongos com acroleína fixador, remoção e corte do cérebro, bem como imunoperoxidase diaminobenzidina-coloração (DAB), a incorporação de resina, seccionamento e ultrafina das seções do cérebro. Após a conclusão desses procedimentos, o material imunocoradas está pronto para exame com TEM. Quando rigorosamente realizada, esta técnica fornece um excelente compromisso entre a preservação ultraestrutural e detecção imunocitoquímica ideal.
Protocol
1. Perfusão animais
- No dia antes da perfusão, prepare:
- 2 L de tampão fosfato (PB; 100 mM, pH 7,4) e 1 L de sódio tampão fosfato (PBS, 0,9% NaCl em 50 mM PB, pH 7,4) em água destilada duas vezes. Armazenar o PBS e 1L de PB a 4 ° C. Estes serão usados para a perfusão e incorporação de pré-imunocitoquímica.
- Solução de 1L de paraformaldeído 4,0% (PFA, pH 7,4) fixador, o que permitirá a perfusão de 6 camundongos. Para o efeito, aquecer 1 L de PB sob uma coifa. Pesar 40 g de paraformaldeído granular (PFA) e despeje na solução PB quando atinge 60 ° C. Quando a solução é clara, com o PFA completamente dissolvido, arrefecer à temperatura ambiente (RT) e armazenar a 4 ° C. - No dia da perfusão, preparar 500 mL de solução de acroleína 3,5% em PB sob uma coifa. Então, filtrar a acroleína 3,5% e 4,0% PFA soluções utilizando papel de filtro.
- Para anestesia mouse, injetar pentobarbital sódico (80 mg / kg) para o peritônio com uma calibre 27 ½ "agulha.
- Durante a perfusão, 50 mL de PBS, 75 ml de acroleína, e 150 mL de PFA serão seqüencialmente passam para a circulação mouse. Para configurar a bomba peristáltica, encha o tubo com PBS e fixar um calibre 23 ¾ "agulha borboleta em uma extremidade. Mergulhe a outra extremidade do tubo na solução de perfusão (PBS, acroleína ou PFA). Definir a velocidade da peristáltica bomba para 20-25 mL / min para os ratos jovens e adultos. Durante a perfusão, evitar cuidadosamente as bolhas de ar que formam na tubulação.
- Espere até que o rato anestesiado não responde mais a estímulos dolorosos, como uma pitada de cauda, antes de prosseguir. Coloque o animal em uma bandeja de dissecação e corrigir as patas com fita. Com uma pinça e tesouras, abrir a pele e cavidade torácica para expor o coração. Para minimizar a isquemia cerebral, a perfusão deve ser iniciada rapidamente. Corte aberto o átrio direito com uma tesoura pequena e iniciar a bomba peristáltica. Enquanto mantém o coração com uma pinça, insira a agulha borboleta no ápice do ventrículo esquerdo.
- Ao mudar solução, parar a bomba peristáltica, a transferência da tubulação de uma solução para outra, e reiniciar a bomba imediatamente.
- Quando 150 mL de PFA passou, parar a bomba peristáltica. Com uma tesoura pequena, corte a cabeça, abrir a pele e quebrar o crânio entre os olhos. Usando uma pinça pequena, com cuidado pegue pequenos pedaços de crânio até o cérebro pode ser facilmente removido. Pós-fix o cérebro por 2 horas a 4 ° C em PFA. Lavar 3 vezes 10 minutos em PBS.
- Imediatamente cortar o cérebro em transversal (50 seções mm de espessura) em ice-cooled PBS usando um vibratome. Com um pincel fino, a transferência de seções selecionadas para imunocitoquímica em um frasco de vidro contendo PBS. Armazenar os restantes secções a -20 ° C em crioprotetor (30% de etileno glicol e glicerol 30% em PBS) por até vários anos.
2. Pré-incorporação imunocitoquímica
- Para imunocitoquímica, as seções são processados livremente flutuando em frascos de vidro. Durante todo o processo, é preciso evitar cuidadosamente deixando seções secar.
- Primeiro, remova a PBS usando uma pipeta de transferência e substituir imediatamente com uma nova solução de borohidreto de sódio a 0,1% em PBS por 30 minutos em temperatura ambiente.
- Enxágüe seções com PBS três vezes 10 minutos, retirando todas as bolhas, e incubar por 2 horas em temperatura ambiente em uma solução de bloqueio de PBS contendo 0,5% de gelatina e 5% de soro normal do animal em que o anticorpo secundário foi gerado (soro de cabra normal em presente exemplo da imunocoloração por Iba1).
- Incubar durante 48 horas com o anticorpo primário em solução de bloqueio. Para Iba1 imunomarcação, utilize o anticorpo de coelho anti-Iba1 (1:1000).
- Enxágüe seções com PBS três vezes 10 minutos e incubar em anticorpo secundário conjugado com biotina (1:1000) em solução de bloqueio por 2 horas em temperatura ambiente.
Para Iba1 imunocoloração, use cabra anti-coelho IgGs. - Enxágüe seções com PBS três vezes 10 minutos e incubar em estreptavidina-peroxidase (1:1000) em solução de bloqueio por 1 hora em temperatura ambiente.
- Enxágüe seções com PBS 10 minutos e com Tris / HCl-buffered saline (TBS, 50 mM, pH 7,4) duas vezes 10 minutos. Para revelar a rotulagem, incubar seções com DAB 0,05% e peróxido de hidrogênio 0,01% em TBS (solução recentemente preparada). Quando a coloração é marrom-escuro (veja o exemplo na Figura 1), parar a reação por lavagem em TBS. Em qualquer caso, a reação final após um máximo de 5 minutos. Enxágüe seções com TBS 10 minutos e com PB 2 vezes de 10 minutos.
3. Processamento para microscopia eletrônica
- Transferência de seções em PB em uma placa de cultura com vários poços usando um pincel fino. Prepare a solução de tetróxido de ósmio 1% em PB sob um capuz fumegante. Remover PB dos poços da placa de cultura e difundir as seções planas com um pincel fino. Seções mergulhadas imediatamente em ósmio 1% por 30 minutos em temperatura ambiente.
- Transferir as seções em frascos de vidro, lave com PB 3 vezes 10 minutos, e desidratar até 2 minutos para imersões ascendente concentrações de etanol: 2 vezes 35%, 1 vez cada um dos 50%, 70%, 80%, 90%, e 95 %, 3 vezes 100%, seguido por três vezes óxido de propileno.
- Para preparar a resina Durcupan, combine 20 g do componente A, 20 g do componente B, 0,6 g do componente C e 0,4 g do componente D em um copo descartável, misture bem até que a cor se torna uniforme, e despeje em uma lata de alumínio pesam prato. Se necessário, blocos de resina podem ser preparados por vazamento de resina em moldes de incorporação e cura em um forno de 55 ° C durante 48-72 horas.
- Usando um pincel fino lavado com óxido de propileno, remova as seções do óxido de propileno e mergulhe na resina Durcupan para impregnação durante a noite a RT.
- No dia seguinte, coloque o prato de alumínio pesam em um forno de 55 ° C por 10 minutos para amolecer a resina. Usando uma escova lavados com óxido de propileno, um filme de revestimento incorporando Aclar com uma fina camada de resina, estabelecer as seções, cubra com outro filme de incorporação, e distribuir pesos leves (cerca de 2 g, por exemplo as tampas de plástico de frascos de vidro) em cima para ajudar a espalhar a resina. Para polimerização da resina, incubar no forno por 48-72 horas (a 55 ° C).
- Após a polimerização, remover os pesos leves e incorporação de filme no topo das seções. Sob um microscópio binocular, selecionar áreas de interesse quadrados (cerca de milímetro 2x2) e com cuidado especial sobre o consumo-los do filme usando uma lâmina de barbear.
- Cole as áreas de interesse na ponta de blocos de resina usando Superglue e cura no forno 55 ° C por 1 hora.
- Em preparação para corte, cortar o bloco de resina com a forma de um trapézio isósceles com uma lâmina de barbear.
- Utilizando um ultramicrótomo e uma faca de vidro, remover a cola e resina na superfície do tecido. Preencha o barco da faca de vidro com água bidestilada e cortar alguns semi-finos (0,5-1 mm de espessura).
- Transferir as seções para um slide SuperFrost com um laço perfeito. Seca das seções, colocando o slide em uma placa de aquecimento a 80 ° C por 1 minuto. Cubra com algumas gotas de 0,1% mancha azul de toluidina (2 g de borato de sódio e 0,2 g azul de toluidina em 200 mL de água bidestilada) por 1 minuto. Lavar o excesso de corante com água destilada duas vezes. Exame das seções com um microscópio de luz permitirá distinguir o tecido manchado a partir da resina (Figura 2).
- Retomar o corte até a fronteira entre o tecido e resina alcança o meio das seções. Note que o procedimento a seguir exige treinamento. Substituir a faca de vidro com uma faca de diamante e preencha o barco com água destilada duas vezes. Prata para cortar seções prata-ouro ultrafinos (60-80 nm de espessura) e cuidadosamente coletá-los em grades de cobre de malha fina usando uma pinça invertida. Seca das grades em um papel de filtro.
- Para melhorar o contraste, as seções ultrafinas podem ser marcadas com citrato de chumbo (0,03 g citrato de chumbo e 0,1 mL de hidróxido de sódio 10N em 10 mL de água bidestilada 1). Usando uma pinça fina invertida, a transferência de uma grade para uma gota de citrato de chumbo por 2 minutos. Retire a grelha e delicadamente enxágüe em três banhos sucessivos de água destilada duas vezes. Por fim, seque as grades de um filtro de papel e guarde-os em uma caixa de grade, até o exame microscópico de elétrons (Figuras 3-6).
4. Resultados representante
Figura 1. Iba1 manchada de secção no nível de luz microscópica. A distribuição celular de Iba1 é restrito a microglia, que mostra a especificidade da imunomarcação. Barra de escala = 100 mm.
Figura 2. Toluidina azul manchado de seção semi-fina no nível de luz microscópica. Nota da fronteira entre o tecido e resina onde a imunomarcação aparecerá mais intensa no microscópio eletrônico.
Figura 3. Ultrafinos seção mostrando Iba1-imunopositivas pericário microglial e processos ao nível da microscopia eletrônica. Iba1 positivo elementos estruturais são reconhecidos por sua imunoperoxidase-DAB precipitar elétron-denso. Barra de escala = 2 m.
Figura 4. Ultrafinos seção exibindo Iba1-imunopositivas processos microglial de tamanhos e formas diferentes ao nível da microscopia eletrônica. Barra de escala = 2 m.
e 5 "/>
Figura 5. Ultrafinos secção que mostra a maior ampliação de um processo Iba1 positivo microglial na Figura 4, permitindo a identificação de suas organelas intracelulares. Barra de escala = 1 mícron.
Figura 6. Secção ultrafinos revelando a maior ampliação das relações entre um processo ultra-Iba1 positivo microglial e elementos próximos de neuropil incluindo sinapses. Barra de escala = 1 Hm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui nós descrevemos um protocolo para a preparação do tecido cerebral do rato para imunomicroscopia que oferece um excelente compromisso entre a preservação ultraestrutural e detecção imunocitoquímica ideal, quando os procedimentos são rigorosamente executado.
Combinado com o TEM, este método permite distinguir elementos celulares com poucas características e critérios de identificação. Em particular, a coloração de imunoperoxidase DAB-de Iba1 permite identificar perikarya microglial e processos, dentro do neuropil, bem como para analisar sua morfologia, organelas intracelulares, e as relações com outros elementos ultra-celular (Figuras 3-6). Além disso, este protocolo permite analisar os locais ultra-estruturais de proteínas solúveis ou ligada à membrana em elementos glial ou neuronal, bem como sua associação com organelas intracelulares. De fato, usando este protocolo com anticorpos específicos, que já revelou a localização ultra-estrutural de 5-HT1A e 5-HT1B receptores serotoninérgicos no perikarya neuronal, dendrites, espinhas dendríticas, os axônios não mielinizados, e células endoteliais de ratos adultos da rafe dorsal núcleo, substantia nigra, globo pálido, hipocampo e 2. Também mostramos a localização ultra-estrutural e EphA4 EphB2 receptores tirosina quinase em vesículas revestidas por clatrina e diferentes elementos astrocíticos e neuronal no hipocampo do rato e do rato e do córtex cerebral, durante o desenvolvimento pós-natal e idade adulta 3,4,5,6. Por último, este protocolo pode ser combinado com pré-incorporação immunogold para analisar as relações entre os ultra-estruturais duas proteínas simultaneamente rotulados, por exemplo, a co-localização de Vglut1 transportador glutamatérgica e EphA4 receptor nos terminais do axônio de rato adulto córtex cerebral 6. Portanto, essa técnica pode ser aplicada com sucesso, sozinho ou em combinação com rotulagem immunogold, para a análise ultra-estrutural de várias proteínas dentro de diferentes regiões e tipos de células do sistema nervoso central, ao longo da vida pós-natal, na saúde e na doença.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos a Shao-Ming Lu e Harris A. Gelbard para o uso de uma bomba peristáltica e vibratome, bem como Karen L. Bentley e Gayle Schneider no Electron Microscope Facility Núcleo de Pesquisa da Universidade de Rochester Medical Center para assistência técnica. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH (EY019277), Fundação Whitehall, Burroughs Wellcome Fund, e Alfred P. Sloan Foundation para AKM. M.-È.T. é financiado por um de Fonds la recherche en santé du Québec (FRSQ) prêmio de treinamento pós-doutorado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital (Nembutal) | OVATION Pharmaceuticals | ||
| Filter paper 315 24 cm | VWR international | 28331-081 | |
| *Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich | 01680 | |
| Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich | 452173 | |
| *Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| *Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive |
| Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich | 82325 | |
| Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher Scientific | 01-291-10 | |
| Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher Scientific | NC9261784 | |
| Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | |
| Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich | 44581 | |
| Gelatin subbed slides | VWR international | 100241-864 | |
| ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Capsule mold | Electron Microscopy Sciences | 70150 | |
| High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | |
| Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | |
| Superfrost slides | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | ||
| Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich | G7765 | |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly. |
|||
References
- Venable, J. H., Coggeshall, R. A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy. J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).
- Riad, M. Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain. J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).
- Tremblay, M. E. Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus. J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).
- Tremblay, M. E. Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus. J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).
- Bouvier, D. Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain. J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).
- Bouvier, D. EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain. J Neurochem. , (2010).
