Summary
Мы опишем протокол для transcardiac перфузии мышей, удаление и срезов мозга, а также иммунопероксидазного окрашивание, смолы вложения, и ультратонких срезов мозга разделов. После завершения этих процедур, immunostained материал будет готов для рассмотрения с просвечивающей электронной микроскопии.
Abstract
Просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) является чрезвычайно полезным для визуализации микроглии, oligodendrocytic, астроцитов и нейронов субклеточных купе (дендрита, дендритных позвоночника, аксона, аксон терминал, perikaryon), а также их внутриклеточных органелл и цитоскелета, в центральной нервной системе при высоким пространственным разрешением. В сочетании с ТЕМ, предварительно вложение иммуноцитохимии позволяет дискриминации клеточных элементов с несколькими отличительными чертами и определение критериев (например, микроглии perikarya и процессов, при использовании антител против микроглии-специфическим маркером Iba1 (ионизированного кальция связывающей молекулы адаптер 1, представленный здесь)), определение нейротрансмиттеров содержание клеточных элементов (например, серотонинергические) и их ультраструктурным локализации растворимых или мембраной белков (например, 5 HT1A и EphA4 рецепторы). Здесь мы опишем протокол для transcardiac перфузии мышей с фиксатором акролеин, удаление и срезов мозга, а также иммунопероксидазного-диаминобензидина (DAB) окрашивание, смолы вложения, и ультратонких срезов мозга разделов. После завершения этих процедур, immunostained материал будет готов для рассмотрения с ТЕА. Когда строго выполняется, этот метод обеспечивает отличный компромисс между оптимальными ультраструктурным сохранение и иммуноцитохимического обнаружения.
Protocol
1. Животное перфузии
- За день до перфузии, подготовить:
- 2 л фосфатном буфере (PB, 100 мМ, рН 7,4) и 1 л натрия фосфат-солевом буфере (PBS, 0,9% NaCl в 50 мМ PB, рН 7,4) в бидистиллированной воде. Магазин PBS и 1л ПБ при 4 ° C. Они будут использоваться для перфузии и предварительно вложение иммуноцитохимия.
- 1л на 4,0% параформальдегида (PFA, рН 7,4), фиксирующие решение, которое позволит перфузии 6 мышей. Для этого нагреть 1 л PB под вытяжкой. Взвесьте 40 г гранулированного параформальдегида (PFA) и вылить в решение ПБ, когда она достигает 60 ° C. Когда раствор не станет прозрачным, с PFA полного растворения, охладить до комнатной температуры (РТ) и хранят при температуре 4 ° C. - В день перфузии, подготовить 500 мл 3,5% раствора в акролеин PB под вытяжкой. Затем, фильтр 3,5% акролеина и 4,0% PFA решений с использованием фильтровальной бумаги.
- Для мыши анестезии, вводят натрия фенобарбитала (80 мг / кг) в брюшину с 27 калибр ½ "иглу.
- Во время перфузии, 50 мл ФСБ, 75 мл акролеин, и 150 мл PFA будет последовательно переходить в мышь обращении. Чтобы настроить перистальтического насоса, заполнить трубопровод с PBS и зафиксировать калибр 23 ¾ "бабочку иглой на одном конце. Погрузите другом конце трубку в перфузии раствором (PBS, акролеин или PFA). Установите скорость перистальтических насоса до 20-25 мл / мин для несовершеннолетних и взрослых мышей. протяжении перфузии, тщательно избегать любых пузырьки воздуха, образующиеся в трубку.
- Подождите, пока наркозом мыши больше не реагирует на болевые стимулы, такие, как хвост крайнем случае, прежде чем продолжить. Положите животное в лоток вскрытия и исправления лапы с помощью липкой ленты. С помощью пинцета и ножниц, откройте кожи и грудной полости, чтобы разоблачить сердце. Чтобы свести к минимуму ишемии мозга, перфузией необходимо начать быстро. Разрежьте правое предсердие с маленькими ножницами и начать перистальтического насоса. Удерживая сердца с помощью пинцета, вставить иглу в бабочку вершина левого желудочка.
- При изменении решения, останавливать перистальтического насоса, передача трубки от одного решения к другому, и перезапустить насос немедленно.
- Когда 150 мл PFA прошла, остановите перистальтического насоса. Использование маленькие ножницы, отрезали головы, открыть кожи, и ломать черепа между глазами. Использование малых пинцетом, осторожно чип от небольшие кусочки черепа до мозга может быть легко удалена. После исправления мозга в течение 2 часов при температуре 4 ° С в PFA. Промыть 3 раза за 10 минут в PBS.
- Сразу же вырезать мозг в поперечном (50 мкм секций) в охлажденной льдом PBS использованием vibratome. С тонкой кистью, передача разделы, отобранных для иммуноцитохимии в стеклянный флакон, содержащий PBS. Магазин остальных разделах при температуре -20 ° С в криопротектора (30% этиленгликоля и 30% глицерина в PBS) в течение нескольких лет.
2. Предварительно вложение иммуноцитохимии
- Для иммуноцитохимия, разделы обрабатываются свободно плавающие в стеклянных флаконах. На протяжении процедуры, нужно тщательно избегать позволяя разделы высохнуть.
- Во-первых, удалите PBS использованием передачи пипетки и немедленно заменить свежим раствором 0,1% натрия боргидрида в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Промыть участки с PBS 3 раза за 10 минут, удаляя все пузыри, и выдержать в течение 2 часов при комнатной температуре в блокировке решение PBS, содержащем 0,5% желатина и 5% нормальных сыворотки животных, в которых вторичные антитела был сгенерирован (нормальная сыворотка козы Настоящий пример Iba1-иммунной).
- Инкубируйте в течение 48 часов с первичными антителами в блокировании решения. Для Iba1-иммуноокрашивания, используйте кролика против Iba1 антител (1:1000).
- Промыть участки с PBS 3 раза за 10 минут и инкубировать в вторичными антителами конъюгированных с биотином (1:1000) в блокировании решения в течение 2 часов при комнатной температуре.
Для Iba1-иммуноокрашивания, использование козьего анти-кролик IgGs. - Промыть участки с PBS 3 раза за 10 минут и инкубировать в стрептавидин-пероксидаза хрена (1:1000) в блокировании решения в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Промыть участки с PBS 10 минут и с Tris / HCl-буферного раствора (TBS, 50 мМ, рН 7,4) 2 раза за 10 минут. Для выявления маркировки, инкубировать секций с 0,05% DAB и 0,01% перекиси водорода в TBS (раствор свежеприготовленный). При окраске темно-коричневый (см. пример на рисунке 1), остановить реакцию, промыв в TBS. В любом случае, конец реакции максимум через 5 минут. Промыть участки с TBS 10 минут и с PB 2 раза за 10 минут.
3. Обработка электронной микроскопии
- Передача разделов в ПБ в пластине многоямного культуры с помощью тонкой кисти. Подготовка 1% растворе осмия в ПБ под дымящей капотом. Удалить PB из скважин культуры пластины и распространение разделы квартира с тонкой кистью. Немедленно погрузите разделов в 1% осмия в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Передача разделов в стеклянных флаконах, промыть 3 раза PB 10 минут, и обезвоживают через 2 минуты погружения в восходящей концентрации этанола: 2 раза 35%, 1 раз в каждом из 50%, 70%, 80%, 90% и 95 %, 3 умноженное на 100%, затем 3 раза оксида пропилена.
- Для подготовки Durcupan смолы, объединить 20 г компонента, 20 г компонента В, 0,6 г компонента С, и 0,4 г компонента Б в одноразовые стакан, хорошо перемешать, пока цвет становится однородным, и вылить в алюминиевые весят блюдо. Если необходимо, смолы блоки могут быть получены путем заливки смолы на вложение формы и лечения в 55 ° С духовке в течение 48-72 часов.
- Использование тонкой кистью промыть окись пропилена, удалите разделы из окиси пропилена и погрузиться в Durcupan смолы для пропитки на ночь при комнатной температуре.
- На следующий день, поставить алюминиевые весят блюдо на 55 ° С духовке в течение 10 минут, чтобы смягчить смолы. Используя щетку промыть окись пропилена, пальто Aclar фильм вложение с тонким слоем смолы, лег разделы, накрыть другой вложение фильма, и равномерно распределить свет весом (около 2 г, например пластиковыми крышками стеклянных флаконах) на вершине, чтобы помочь смола распространяется. Для полимеризации смолы, инкубировать в духовке в течение 48-72 часов (при 55 ° С).
- После полимеризации, удалить легкие веса и внедрение пленка на верхней части секции. Под бинокулярный микроскоп, выберите квадратных областей, представляющих интерес (примерно 2x2 мм) и тщательно акцизного их из пленки с использованием лезвия бритвы.
- Клей областях, представляющих интерес на кончике смолы блоков, используя суперклей и лечения в 55 ° C духовку на 1 час.
- В ходе подготовки к секционирования, обрезки смолы блок форму равнобедренной трапеции с лезвия бритвы.
- Использование ультрамикротоме и стекло ножом, удалить клей и смолы на поверхности ткани. Заполните лодка стекла нож с двойным дистиллированной воде и нарезать несколько полу-тонкие срезы (0.5-1 мкм).
- Передача разделы SuperFrost слайд с идеальной цикла. Сухой разделах, поставив скользят по плитке при 80 ° С в течение 1 минуты. Крышка с нескольких капель 0,1% толуидиновым синим пятном (2 г бората натрия и 0,2 г толуидиновым синим в 200 мл дистиллированной воды) в течение 1 минуты. Промыть избыток пятно с двойным дистиллированной воды. Изучение разделов с световой микроскоп позволит отличить окрашенных тканей из смолы (рис. 2).
- Резюме резки, пока граница между тканью и смолы достигает середины секций. Обратите внимание, что следующая процедура требует подготовки. Замените стекло нож с ножом алмазов и заполнить лодку с двойным дистиллированной воды. Вырезать серебро серебро-золото ультратонкие срезы (60-80 нм) и тщательно собирает их по медной сетки сетки с использованием тонких перевернутой пинцетом. Сухой сеток на фильтровальную бумагу.
- Для повышения контрастности, ультратонкие срезы могут быть окрашивали цитратом свинца (0,03 г цитрата свинца и 0,1 мл 10N гидроксида натрия в 10 мл бидистиллированной воды 1). Использование тонких перевернутой пинцет, передача сетки капли цитратом свинца в течение 2 минут. Снимите сетку и осторожно промыть в 3-х последовательных ванн бидистиллированной воды. Наконец, сухой сеток на фильтровальную бумагу и храните их в сетку окна, пока электронная микроскопия (рис. 3-6).
4. Представитель Результаты
Рисунок 1. Iba1 окрашенных раздел на свет микроскопическом уровне. Клеточное распределение Iba1 ограничивается микроглии, которая показывает специфику иммунной окраски. Шкала бар = 100 мкм.
Рисунок 2. Толуидин сине-окрашенных полу-шлиф на свет микроскопическом уровне. Обратите внимание на границе между тканью и смолой, где иммуноокрашивания появятся наиболее интенсивна в электронный микроскоп.
Рисунок 3. Ультратонких раздел показывает Iba1-иммунопозитивных микроглии perikaryon и процессов на электронно-микроскопического уровня. Iba1-позитивных структурных элементов можно узнать по иммунопероксидазного-DAB электронно-плотного осадка. Шкала бар = 2 мкм.
Рисунок 4. Ультратонких разделе отображения Iba1-иммунопозитивных микроглии процессов различных размеров и форм, в электронно-микроскопического уровня. Шкала бар = 2 мкм.
£ 5 "/>
Рисунок 5. Ультратонких разделе показ в большем увеличении Iba1-положительных микроглии процесса из рисунка 4, позволяющая определять его внутриклеточных органелл. Шкала бар = 1 мкм.
Рисунок 6. Ультратонких разделе выявления на большем увеличении ультраструктурным отношения между Iba1-положительных микроглии процесса и близлежащие элементы нейропиля в том числе синапсов. Шкала бар = 1 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы описали протокол для подготовки ткани мозга мыши для иммуноэлектронной микроскопии, которая обеспечивает отличный компромисс между оптимальными ультраструктурным сохранение и иммуноцитохимического обнаружения, когда процедуры строго выполняется.
В сочетании с ТЕМ, этот метод позволяет различать клеточные элементы с несколькими отличительными чертами и определение критериев. В частности, иммунопероксидазного-DAB окрашивание Iba1 позволяет выявить микроглии perikarya и процессов, в рамках нейропиля, а также для анализа их морфологии, внутриклеточных органелл, и ультраструктурные отношения с другими клеточными элементами (рис. 3-6). Кроме того, этот протокол позволяет анализировать ультраструктурным местах растворимых или мембраной белков в глиальных элементов или нейронов, а также их связь с внутриклеточных органелл. Действительно, используя этот протокол со специфическими антителами, ранее мы показали, ультраструктурным локализации 5-HT1A и 5-HT1B серотонинергические рецепторы нейронов perikarya, дендриты, дендритных шипиков, немиелинизированных аксонов, и эндотелиальные клетки взрослой крысы шва спинной ядра, субстанции черная, бледного шара, и в гиппокампе 2. Мы также показали, ультраструктурным локализации EphA4 и EphB2 тирозин киназ рецепторов в клатриновых пузырьков и различных астроцитов и нейронов элементов в гиппокампе мышей и крыс и коры головного мозга, во время постнатального развития и взрослом возрасте 3,4,5,6. Наконец, этот протокол может быть объединен с предварительно вложение immunogold проанализировать ультраструктурным отношения между двумя одновременно меченых белков, например, совместно локализации Vglut1 глутаматергической транспортер и EphA4 рецепторов в аксон терминалы взрослой мыши коры головного мозга 6. Таким образом, эта методика может с успехом применяться по отдельности или в комбинации с маркировки immunogold, для ультраструктурным анализа различных белков в разных регионах и типах клеток центральной нервной системы, на протяжении постнатальной жизни, в норме и патологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Шао-Минг Лу Харрис и А. Гелбард для использования перистальтического насоса и vibratome, а также Карен Л. Бентли и Гейл Шнайдер в электронный микроскоп исследований Основные фонда из Университета Рочестера медицинский центр для оказания технической помощи. Эта работа финансировалась за счет грантов от NIH (EY019277), Уайтхолл Фонда Burroughs Wellcome фонд и Фонд Альфреда П. Слоуна в АКМ. M.-È.T. финансируется за счет Fonds-де-ла изысканная ан santé Квебека (FRSQ) докторской награды обучения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium pentobarbital (Nembutal) | OVATION Pharmaceuticals | ||
| Filter paper 315 24 cm | VWR international | 28331-081 | |
| *Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich | 01680 | |
| Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich | 452173 | |
| *Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol |
| *Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive |
| Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich | 82325 | |
| Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher Scientific | 01-291-10 | |
| Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher Scientific | NC9261784 | |
| Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | |
| Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | |
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich | 44581 | |
| Gelatin subbed slides | VWR international | 100241-864 | |
| ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| Capsule mold | Electron Microscopy Sciences | 70150 | |
| High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | |
| Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | |
| Superfrost slides | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | ||
| Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich | G7765 | |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly. |
|||
References
- Venable, J. H., Coggeshall, R. A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy. J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).
- Riad, M. Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain. J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).
- Tremblay, M. E. Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus. J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).
- Tremblay, M. E. Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus. J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).
- Bouvier, D. Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain. J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).
- Bouvier, D. EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain. J Neurochem. , (2010).
