Generatie van primaire mammosfeer: een techniek om celpotentie te bepalen

Overview

Deze video beschrijft het isoleren van kankerstamcellen van borstkankercellijnen. We kweeken deze kankerstamcellen om primaire mammosfeer te genereren voor het beoordelen van zelfvernieuwing en het berekenen van sfeervormende efficiëntie, waardoor vergelijking tussen verschillende zaaidichtheden mogelijk is.

Protocol

1. Generatie van primaire mammosfeer van menselijke borstkankercellijnen

OPMERKING: Voer de volgende stappen uit onder een steriele kweekkap.

1. Bereid Mammosphere Media met DMEM/F12 aangevuld met 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicilline, 100 U/ml streptomycine. Bereid volledige media onmiddellijk voor gebruik voor door 20 ng/ml recombinante menselijke epidermale groeifactor (EFG; Sigma), 10 ng/ml recombinante menselijke basis fibroblast groeifactor (bFGF; R&D Systemen) en 1x B27 supplement.
2. Aspireer media uit kolf met aanhangende MCF-7 of MDA-MB-231 cellen (of een borstkankercellijn naar keuze; 70-80% samenvloeiing), was tweemaal in 1x PBS en probeer cellen te trypsiniseren.
3. Centrifugeer cellen op 200 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Decanteer supernatant en resuspend cellen in 1-5 ml mammosfeermedia. Pipetteer op en neer en gebruik indien nodig een 40 μm celzeefdopfilter om eencellige suspensie te verkrijgen. Gebruik een hemocytometer om ervoor te zorgen dat er een enkele celsuspensie is gevormd (zo niet, gebruik dan een naald van 25 G om de celsuspensie tot 3 keer te spuiten).
4. Isoleer indien nodig CD44+CD24- cellulaire subset via FACS met behulp van anti-CD24-fycoerythrine (PE) en anti-CD44-fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) monoklonale antilichamen⁹. Als alternatief kunt u een dergelijke populatie isoleren met behulp van een macs-systeem (magnetic-activated cell sorting) met anti-CD44 en anti-CD24-biotine gecombineerde microbeads volgens de instructies van de fabrikant. Voer positieve selectie uit met behulp van LS-kolommen en negatieve selectie met behulp van LD-kolommen en bevestig de fenotypen van alle geïsoleerde cellen door flowcytometrie.
5. Bereken het aantal levensvatbare cellen per ml met trypan blauw.
   OPMERKING: De levensvatbaarheid van cellen wordt berekend als het aantal levensvatbare cellen gedeeld door het totale aantal cellen binnen de rasters op de hemocytometer. Cellen die trypanblauw opnemen, worden als niet-levensvatbaar beschouwd. De volgende procedure wordt gebruikt om het aandeel levensvatbare cellen nauwkeurig te bepalen.
   1. Bereid een 0,4% oplossing van trypan blauw in PBS. Voeg 0,1 ml trypan blauwe bouillonoplossing toe aan 1 ml cellen. Laad een hemocytometer en onderzoek onmiddellijk onder een microscoop bij lage vergroting. Tel het aantal totale cellen en het aantal blauwe kleurcellen. Levensvatbare cellen = [1,00 – (Aantal blauwe cellen ÷ Aantal totale cellen)] × 100.
   2. Gebruik de onderstaande formule om het aantal levensvatbare cellen per ml cultuur te berekenen. Vergeet niet om te corrigeren voor de verdunningsfactor.
      Aantal levensvatbare cellen × 10⁴ × 1,1 = cel/ml kweek
6. Resuspend een vooraf bepaalde hoeveelheid cellen in 2 ml complete mammosfeermedia in elke put van een 6-put ultra-lage aanhangplaat. De zaaidichtheid is normaal gesproken 500-4.000 cellen/cm² cel per put. Gebruik eventueel 24-putplaten met een lage bevestiging tijdens het zaaien van cellen met dezelfde dichtheid in 0,5 ml media.
   OPMERKING: We raden aan om de seedingdichtheid en de tijd van cultuur voor elke cellijn te optimaliseren.
7. Incubeer ultra low-attachment 6-well platen bij 37 °C en 5% CO₂ gedurende 5-10 dagen (afhankelijk van de cellijn en de grootte van mammospheres) zonder de platen te verstoren, vooral tijdens de groeifase van de eerste 5 dagen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Lonza	CC-3151
2 mM L-glutamine	Sigma Aldrich	G8540
100 U/ml Penicillin & Streptomycin	Sigma Aldrich	P4083
20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	Sigma Aldrich	E9644
20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)	R&D systems	233-FB-025
1x B27 supplement	Invitrogen	17504-044
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Scientific	12399902
0.5% trypsin/0.2% EDTA	Sigma Aldrich	59418C
Fetal calf serum	First Link UK	02-00-850
Trypan blue	Sigma Aldrich	93595
Low attachment 6-well plates	Corning	CLS3814