Overview
וידאו זה מתאר בידוד תאי גזע סרטניים מקווי תאים סרטניים בשד. אנו תרבות אלה תאי גזע סרטניים כדי ליצור ממוגרפיה ראשונית להערכת התחדשות עצמית וחישוב יעילות יצירת כדור, המאפשר השוואה על פני צפיפויות זריעה שונות.
Protocol
1. דור הממוספרות העיקריות מקווי התאים של סרטן השד האנושי
שים לב: בצע את השלבים הבאים מתחת למכסה המנוע של התרבות הסטרילית.
- הכן מדיה ממוספרית המכילה DMEM/F12 בתוספת 2 מ"מ ל-גלוטמין, 100 U/ml פניצילין, 100 U/ml סטרפטומיצין. הכן מדיה מלאה מיד לפני השימוש על ידי הוספת 20 ננוגרם / מיליליטר גורם גדילה אפידרמיס אנושי רקומביננטי (EGF; סיגמא), 10 ng/ml גורם גדילה פיברובלסט אנושי בסיסי (bFGF; מערכות R&D) ותוסף 1x B27.
- שאפתן מדיה מבקבוק המכיל תאים MCF-7 חסידים או MDA-MB-231 (או קו תאים סרטני השד על פי בחירתך; 70-80% מפגש), לשטוף פעמיים 1x PBS, ולנסות תאים.
- תאי צנטריפוגה ב 200 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. פענוח תאים על טבעיים ו resuspend ב 1-5 מ"ל של מדיה mammosphere. פיפטה למעלה ולמטה ובמידת הצורך להשתמש מסנן 40 תא מסננת תאים כדי להשיג השעיה של תא יחיד. השתמש hemocytometer כדי להבטיח השעיה תא יחיד נוצר (אם לא, להשתמש במחט 25 G כדי מזרק השעיית התא עד 3 פעמים).
- במידת הצורך לבודד CD44 +CD24- קבוצת משנה הסלולר באמצעות FACS באמצעות נוגדנים חד שבטיים נגד CD24-phycoerythrin (PE) ואנטי CD44-פלואורסצנטיים isothiocyanate (FITC) נוגדנים חד שבטיים9. לחלופין, לבודד אוכלוסייה כזו באמצעות מערכת מיון תאים המופעלת מגנטית (MACS) עם אנטי CD44 ואנטי CD24-ביוטין משולב microbeads לפי הוראות היצרן. בצע בחירה חיובית באמצעות עמודות LS ובחירה שלילית באמצעות עמודות LD ואשר את הפנוטיפים של כל התאים המבודדים לפי ציטומטריית זרימה.
- חשב את מספר התאים בני קיימא לכל מ"ל באמצעות כחול trypan.
שים לב: הכדאיות של התא מחושבת כמספר התאים בני קיימא חלקי המספר הכולל של תאים בתוך הרשתות על המוציטרומטר. תאים שתועלים כחול טריפאן נחשבים בלתי קיימא. ההליך הבא משמש כדי לקבוע במדויק את חלקם של תאים בני קיימא.- הכינו פתרון של 0.4% לכחול טריפאן ב-PBS. הוסף 0.1 מ"ל של פתרון מלאי כחול trypan ל 1 מ"ל של תאים. לטעון hemocytometer ולבחון מיד תחת מיקרוסקופ בהגדלה נמוכה. ספור את מספר התאים הכולל ואת מספר התאים הכתמים הכחולים. תאים בני קיימא = [1.00 – (מספר התאים הכחולים ÷ מספר התאים הכולל)] × 100.
- כדי לחשב את מספר התאים בני קיימא לכל מ"ל של תרבות, השתמש בנוסחה שלהלן. זכור לתקן את גורם הדילול.
מספר תאים בני קיימא × 104 × 1.1 = תאים / מיליליטר תרבות
- Resuspend כמות שנקבעה מראש של תאים 2 מ"ל של מדיה mammosphere מלאה בכל באר של צלחת 6-well אולטרה נמוך חסידים. צפיפות הזריעה היא בדרך כלל 500-4,000 תאים / ס"מ2 תאים לבאר. לחלופין, השתמש בלוחות 24 בארות בחיבור נמוך תוך זריעת תאים באותה צפיפות ב- 0.5 מ"ל של מדיה.
שים לב: אנו ממליצים על אופטימיזציה של צפיפות הזריעה וזמן התרבות עבור כל קווי תאים מעניינים. - דגירה אולטרה חיבור נמוך 6-באר צלחות ב 37 °C ו 5% CO2 במשך 5-10 ימים (בהתאם לקו התא ואת הגודל של ממוספרות) מבלי להפריע הצלחות, במיוחד בשלב הצמיחה של 5 הימים הראשונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
2 mM L-glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
100 U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Scientific | 12399902 | |
0.5% trypsin/0.2% EDTA | Sigma Aldrich | 59418C | |
Fetal calf serum | First Link UK | 02-00-850 | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
Low attachment 6-well plates | Corning | CLS3814 |