Overview
이 비디오는 유방암 세포주에서 암 줄기 세포를 고립시키는 것을 설명합니다. 우리는 이러한 암 줄기 세포를 배양하여 자가 재생을 평가하고 구체 형성 효율을 계산하기 위한 1 차적인 맘모스피어를 생성하여 다른 종자 밀도에 걸쳐 비교를 허용합니다.
Protocol
1. 인간 유방암 세포 선에서 1 차 유방 스피어의 생성
참고: 멸균 배양 후드 아래에서 다음 단계를 수행합니다.
- 2mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 U/ml 연쇄상 구균제로 보충 DMEM/F12를 포함하는 맘모스피어 미디어를 준비하십시오. 20 ng/ml 재조합 인간 표피 성장 인자 (EGF) 추가 하 여 사용 직전에 완전 한 미디어를 준비; 시그마), 10 ng/ml 재조합 인간 기본 섬유아세포 성장 인자 (bFGF; R&D 시스템) 및 1x B27 보충.
- 부착 된 MCF-7 또는 MDA-MB-231 세포 (또는 당신의 선택의 유방암 세포 주; 70-80 % 합류)를 포함하는 플라스크에서 흡인 매체는 1 x PBS에서 두 번 세척하고 세포를 트립시닉합니다.
- 원심 분리기 세포는 실온에서 200 x g에서 5 분 동안. 매머스피어 미디어의 1-5 ml에서 셀을 극열 및 재중단한다. 파이펫은 위아래로 40 μm 셀 스트레이너 캡 필터를 사용하여 단일 셀 서스펜션을 얻습니다. 단일 세포 현탁액이 형성되었는지 확인하기 위해 혈종계를 사용하여 (그렇지 않은 경우 25 G 바늘을 사용하여 세포 현탁액을 최대 3 배까지 주사기를 하십시오).
- 필요한 경우 CD44+CD24-세포 서브세트를 사용하여 반대로 CD24-피코에리스린(PE) 및 안티CD44-플루오레스세인 이소티오냐네이트(FITC) 단일클론 항체9을이용하여 세포 하위 집합을 분리하였다. 또는 제조업체의 지침에 따라 안티 CD44 및 안티 CD24-비오틴 결합 마이크로비드를 사용하여 이러한 인구를 분리합니다. LS 컬럼을 이용하여 양수 선택을 수행하고, LD 열을 사용하여 음수 선택을 수행하고, 유동 세포측정에 의해 모든 분리된 세포의 표현형을 확인한다.
- 트라이판 블루를 사용하여 ml 당 실행 가능한 셀수를 계산합니다.
참고: 세포 생존가능성은 혈종계의 격자 내의 총 셀 수로 나누어질 실행 가능한 세포의 수로 계산됩니다. 트라이판 블루를 차지 하는 세포는 실행 가능한 것으로 간주 됩니다. 다음 절차는 실행 가능한 세포의 비율을 정확하게 결정하는 데 사용됩니다.- PBS에서 트립팬 블루의 0.4% 솔루션을 준비합니다. 1 ml의 셀에 트라이판 블루 스톡 용액 0.1 ml를 추가합니다. 혈전계를 적재하고 낮은 배율에서 현미경으로 즉시 검사합니다. 총 셀 수와 파란색 염색 셀 수를 계산합니다. 실행 가능한 세포 = [1.00 – (전체 셀의 수 ÷ 청색 세포의 수)] × 100.
- 배양ml당 실행 가능한 셀 수를 계산하려면 아래 수식을 사용하십시오. 희석 계수를 수정해야 합니다.
실행 가능한 세포의 수 × 104 × 1.1 = 세포 /ml 배양
- 6웰 초저부착 플레이트의 각 웰에서 완전한 매머스피어 미디어 2ml에서 미리 결정된 양의 세포를 재연한다. 파종 밀도는 일반적으로 500-4,000 세포/cm2 셀당 잘 된다. 선택적으로 낮은 부착 24웰 플레이트를 사용하는 동시에 0.5 ml의 매체에서 동일한 밀도로 세포를 파종합니다.
참고: 각 세포주에 대한 종자 밀도와 배양 시간을 최적화하는 것이 좋습니다. - 특히 처음 5일 간의 성장 단계에서 플레이트를 방해하지 않고 5-10일 동안 37°C 및 5%CO 2(세포주 및 매머스피어 크기에 따라 다름)로 초저부착 6웰 플레이트를 배양한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Lonza | CC-3151 | |
| 2 mM L-glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | |
| 100 U/ml Penicillin & Streptomycin | Sigma Aldrich | P4083 | |
| 20 ng/ml Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | Sigma Aldrich | E9644 | |
| 20 ng/ml Recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF) | R&D systems | 233-FB-025 | |
| 1x B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Scientific | 12399902 | |
| 0.5% trypsin/0.2% EDTA | Sigma Aldrich | 59418C | |
| Fetal calf serum | First Link UK | 02-00-850 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | |
| Low attachment 6-well plates | Corning | CLS3814 |
