3D الثقافة المشتركة مع التفاعل المباشر: شارك في زراعة الخلايا السرطانية مع Monocytes لدراسة تفاعلها

Overview

يصف هذا الفيديو الثقافة المشتركة ثلاثية الأبعاد لخلايا سرطان الثدي مع الخلايا الأحادية لدراسة تفاعلها في بيئة قائمة على مستخلص مصفوفة خارج الخلية (ECME). تساعد هذه الطريقة في دراسة ميزات محددة مثل تدهور الكولاجين وتجنيد الخلايا المناعية وغزو الخلايا.

Protocol

1.3D الثقافات المشتركة مع التفاعل المباشر

1. تسمية خلايا BrC و monocytes مع الأصباغ الفلورية المختلفة قبل ثقافة الخلية للسماح فرز مستقل من كل سلالة الخلية بعد الثقافة لتحليل الحمض النووي الريبي والتعبير البروتين. استخدام المشتقات المتاحة تجاريا من الكومارين ورودامين التي تمر بحرية من خلال غشاء الخلية من الخلايا الحية. بروتوكول عام وضع العلامات هو ما يلي:
   1. إعداد طبقة أحادية من خلايا BrC ذات الفائدة (2 ×^{10 6} خلايا في قارورة ثقافة^{25 سم 2)} واستبدال الوسط القياسي بمحلول عمل كاف مسبق الدفء للصبغة الفلورية (1:2000 من صبغة الفلورسنت في وسط أساسي قياسي دون أي ملحق). احتضان 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في بيئة رطبة 5٪ CO_2. يستنشق محلول الصبغة ويشطف بلطف مع برنامج تلفزيوني 1x كافية. يستنشق برنامج تلفزيوني وإضافة المتوسطة القياسية.
   2. جرب خلية monolayer مع 2 مل من حل من 0.05٪ تريبسين و 0.48 m M EDTA لمدة 5-10 دقيقة في 37 درجة مئوية. إضافة 200 ميكرولتر من FBS لوقف المحاولة و 7 مل من وسيط المراسل دون ملاحق. إعادة إنفاق الخلايا عن طريق الأنابيب. تأخذ aliquot من 10 ميكرولتر لحساب الخلايا في غرفة نيوباور. متابعة بروتوكول الثقافة المشتركة بعد عد الخلايا.
   3. بيليه الخلايا في 430 × ز لمدة 5 دقائق في RT (أداء هذا الأول منذ monocytes تنمو في التعليق). تجاهل supernatant وخلايا resuspend بلطف مع 3 مل من محلول العمل قبل تسخينها من صبغة الفلورسنت (1:2,000 من صبغة الفلورسنت في وسط قاعدة قياسية دون ملاحق). احتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في بيئة رطبة 5٪ CO_2.
   4. بيليه الخلايا مرة أخرى، والتخلص من محلول العمل صبغ، وإعادة الإنفاق بلطف مع 5-7 مل من برنامج تلفزيوني 1x. بيليه مرة أخرى، والتخلص من برنامج تلفزيوني، وخلايا إعادة الإنفاق في 5-7 مل من المتوسطة القياسية. اتخاذ aliquot من 10 ميكرولتر من تعليق الخلية لحساب الخلايا في غرفة نيوباور. متابعة بروتوكول الثقافة المشتركة بعد عد الخلايا.
2. تعيين الثقافة المشتركة على النحو التالي: نشر ما يكفي ECME في الجزء السفلي من البئر لتشكيل طبقة حتى في كل بئر من نظام الشريحة غرفة 4-جيدا. لوحة 20 ميكرولتر من تعليق خلية واحدة تحتوي على 5 × 10⁵ وصفت خلايا BrC لكل بئر.
3. بعد 15-20 دقيقة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، أضف تعليقا قدره 2.5 × 10⁵ خلايا أحادية ملصقة في 80 ميكرولتر متوسطة (تكملها 60٪ ECME).
4. السماح ECME لترسيخ لمدة 15-20 دقيقة في 37 درجة مئوية.
5. أضف 1 مل من مزيج 1:1 من خلايا BrC ووسائل الإعلام الثقافية الأحادية.
6. احتضان الثقافات المشتركة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في_بيئة رطبة تبلغ 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة أو 48 ساعة أو 5 أيام لتتبع التغيرات في نقاط زمنية مختلفة.
7. تتحلل بروتينات ECM لاستعادة الخلايا من الثقافات. أسبيرات وتجاهل المتوسطة، إضافة 0.5 مل من برنامج تلفزيوني 1x مع 0.1٪ تريبسين و 0.25٪ EDTA، واحتضان لمدة 3 ساعة في 37 درجة مئوية. بعد الحضانة، إضافة 0.5 مل من برنامج تلفزيوني 1x مع 10٪ FBS لتحييد تريبسين، وإعادة إنفاق الخلايا عن طريق الأنابيب بقوة للحصول على تعليق خلية واحدة.
8. بيليه الخلايا في 765 × ز لمدة 5 دقائق في RT، والتخلص من supernatant، وإعادة إنفاق الخلايا في 5 مل من برنامج تلفزيوني 1x مع 10٪ FBS. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
9. إخضاع تعليق الخلية لفرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) باستخدام الأداة المناسبة. تأكد من أن السكان النهائيين هم على الأقل 95٪ نقية).
10. بعد الفرز، وغسل الخلايا مع عقيمة 1x برنامج تلفزيوني، بيليه (430 × ز لمدة 5 دقائق في RT)، وإعادة الإنفاق في برنامج تلفزيوني 1x عقيمة. يمكن معالجة الخلايا وفقا لبروتوكولات محددة لعزل الحمض النووي الريبي أو تحليل البروتين.
11. كرر كل المقايسة ثلاث مرات، بما في ذلك الثقافات 3D من كل سلالة الخلية الفردية كعناصر تحكم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
U937	American Type Culture Collection ATCC	CRL-1593.2	Monocytic cell line/histiocytic lymphoma
THP-1	American Type Culture Collection ATCC	TIB-202	Monocytic cell line/acute monocytic leukemia
MCF-10A	American Type Culture Collection ATCC	CRL-10317	Non-transformed breast cell line
MCF-7	American Type Culture Collection ATCC	HTB-22	Breast Cancer Cell line
MDA-MB-231	American Type Culture Collection ATCC	HTB-26	Breast Cancer Cell line
RPMI 1640 medium	GIBCO BRL Life Technologies	11875-093
DMEM/F12	GIBCO BRL Life Technologies	11039-021
Antibiotic/Antimycotic	GIBCO BRL Life Technologies	15240-062	100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone
Fetal Bovine Serum	GIBCO BRL Life Technologies	16000-044
Horse serum	GIBCO BRL Life Technologies	16050114
0.05% Trypsin-EDTA 1X	GIBCO BRL Life Technologies	25300-062
PBS 1X (Phosphate Buffered Saline	GIBCO BRL Life Technologies	20012-027
Epidermal Growth Factor (EGF)	PeproTech	AF-100-15 (1.00mg)
Insulin	SIGMA-ALDRICH	I1882-100MG
Hydrocortisone	SIGMA-ALDRICH	H088-5G
Cholera toxin Vibrio cholerae	SIGMA-ALDRICH	C8052-1MG
Matrigel	Corning Inc	356237	Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C
Lab-Tek chamber slide with cover (8 well)	Nalge Nunc International	177402