Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
للبدء، أضف الكولاجين DQ IV، وهو ركيزة بروتين مروية صبغة فلورية في مستخلص مصفوفة خارج الخلية أو ECME. صب هذا المقتطف في كل بئر من شريحة بئر اثنين. تسمية الأولى وكذلك الثقافة المشتركة، والثانية كعنصر تحكم. إضافة كمية مناسبة من تعليق الخلايا السرطانية المسمى fluorescently في الآبار، واحتضان الشريحة في 37 درجة مئوية للوقت المطلوب لتعزيز مرفق الخلية.
إضافة كمية مطلوبة من تعليق الخلية monocytes إلى البئر الأول. دع ECME تتوطد عند 37 درجة مئوية. صب نسب متساوية من الخلايا السرطانية والوسائط ثقافة monocyte في كل بئر واحتضان الشريحة في 37 درجة مئوية للمدة المرجوة في بيئة ثاني أكسيد الكربون. في الثقافة المشتركة بشكل جيد ، تفرز الخلايا السرطانية بروتينات مثل البروتين chemoattractant monocytes لجذب الخلايا الأحادية.
في المقابل ، تنتج الخلايا الأحادية مصفوفة metalloproteinase أو MMP ، لإضعاف الكولاجين ، وتعزيز غزو الخلايا السرطانية. مراقبة الشريحة تحت المجهر confocal. ينبعث من تدهور الكولاجين DQ مضان يمكن رؤيته أكثر في خلايا الثقافة المشتركة التي تشير إلى تفاعل الخلايا ، في حين أنه أقل في خلايا التحكم. في البروتوكول التالي، سوف نقوم بزراعة خلايا سرطان الثدي مع الخلايا الأحادية لدراسة تفاعلها.
لتسمية خلايا BRC والخلايا الأحادية مع الكومارين والرودامين المتاحة تجاريا قبل ثقافة الخلية ، وإعداد طبقة أحادية من مرتين 10 إلى خلايا BRC الستة ذات الاهتمام واستبدال الوسط القياسي بحل عمل كاف قبل الحرب من الصبغة الفلورية. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في بيئة رطبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. ثم يستنشق محلول الصبغة واستخدام ما يكفي من برنامج تلفزيوني 1x لشطف الخلايا بلطف.
يستنشق برنامج تلفزيوني وإضافة المتوسطة القياسية. لتجربة الخلايا إضافة اثنين من ملليلتر من 0.05٪ تريبسين و 0.48 ملليمولار EDTA إلى القارورة، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 5 إلى 10 دقائق. إضافة 200 ميكرولتر من FBS لوقف المحاولة وسبعة ملليلتر من المتوسط المقابلة دون ملاحق.
إعادة إنفاق الخلايا عن طريق الأنابيب، ثم نقل 10 ميكرولترات من الخلايا إلى غرفة نيوباور والعد لهم. بعد ذلك ، بيليه الخلايا في 430 × ز في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، ثم تجاهل supernatant واستخدام ملليلتر من صبغة الفلورسنت prewarmed حل العمل لتعليق الخلايا.
احتضان تعليق الخلايا في 37 درجة مئوية في بيئة مرطبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة. بعد بيليه الخلايا مرة أخرى، تجاهل محلول العمل صبغ واستخدام 5 إلى 7 ملليلتر من برنامج تلفزيوني 1x لإعادة إنفاق الخلايا بلطف. ثم بعد بيليه الخلايا مرة أخرى والتخلص من برنامج تلفزيوني، resuspended الخلايا في 5 إلى 7 ملليلتر من المتوسطة القياسية.
عد 10 ميكرولترات من تعليق الخلية. إعداد ثقافة مشتركة من خلال نشر ما يكفي من ECME في الجزء السفلي من البئر لتشكيل طبقة متعادلة في كل بئر من نظام الشرائح غرفة أربعة آبار. لوحة 20 ميكرولتر من تعليق خلية واحدة تحتوي على 5 مرات 10 إلى الخامس المسمى خلايا BRC لكل بئر. بعد 15 إلى 20 دقيقة في 37 درجة مئوية، إضافة تعليق من 2.5 مرات 10 إلى monocytes المسمى الخامس في 80 ميكرولتر من متوسط المقايسة، تكملها مع ECME 60٪.
السماح للECME لترسيخ 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة. الآن، إضافة 1 ملليلتر من خليط 1:1 من خلايا BRC ووسط ثقافة monocyte. احتضان الثقافات المشتركة عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة 24 ساعة أو 48 ساعة أو خمسة أيام لتتبع التغيرات في نقاط زمنية مختلفة.
لإضعاف بروتينات ECM واستعادة الخلايا من الثقافات، يستنشق وتجاهل المتوسطة ثم إضافة 0.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني 1x مع 0.1٪ تريبسين و 0.25٪ EDTA إلى الثقافة. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد الحضانة، إضافة 0.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني 1x مع 10٪ FBS لتحييد تريبسين وإعادة إنفاق الخلايا عن طريق الأنابيب بقوة للحصول على تعليق خلية واحدة.
بعد بيليه الخلايا، والتخلص من supernatant وإعادة إنفاق الخلايا في خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني 1x مع 10٪ FBS. كرر الخطوة مرة واحدة. إخضاع تعليق الخلية إلى FACS باستخدام الأداة المناسبة. تأكد من أن السكان النهائيين هم على الأقل 95٪ نقية.
