Transplante Limb-Hind ortotópico em ratos

Summary

Aqui nós descrevemos o rato ortotópico membro-hind procedimento de transplante, o que parece ser o padrão ouro

Abstract

Alógenos de tecido composto (CTA) agora representa uma opção terapêutica válida após a perda de uma mão, antebraço ou dígitos e tornou-se uma nova entidade terapêutica em cirurgia reconstrutiva. No entanto, a longo prazo de altas doses de terapia multi-droga imunossupressora é necessária para garantir a sobrevida do enxerto, com o risco de efeitos secundários graves que cabrestos mais ampla aplicação. Progressão neste campo pode depender de uma melhor compreensão da imunologia básica e isquemia e reperfusão em enxertos de tecido composto.

Até o momento, o transplante ortotópico membro pélvico em ratos tem sido o modelo preferido para roedores reconstrutiva transplante (RT), no entanto, é um procedimento extremamente exigente, que requer técnicas de microcirurgia extraordinária para o reatamento da vasculatura, ossos, músculos e nervos.

Nós introduzimos a técnica de anastomose vascular manguito a este modelo, oferecendo uma abordagem rápida e confiável para o transplante dos membros posteriores de ratos. Esta técnica simplifica e encurta o procedimento cirúrgico e permite que os cirurgiões com experiência microcirúrgica básico para conseguir realizar a operação com a sobrevivência alta e baixas taxas de complicação. A técnica parece ser adequada para imunológica, assim como lesão de reperfusão de isquemia (IRI) estudos.

Protocol

Operação dos doadores e Limb Hind-Colheita

1. Para o procedimento operatório um conjunto estéril de instrumentos de microcirurgia é utilizado. O cirurgião deve usar vestuário adequado, incluindo luvas estéreis, que devem ser alterados antes do início do procedimento cirúrgico.
2. O rato é anestesiados com injeção intraperitoneal de pentobarbital (50mg/kg IP) e colocado em posição supina em um campo de operação aquecida, o que facilita a temperatura do corpo estável animais durante todo o procedimento cirúrgico.
3. Antes da incisão na pele do campo da operação é higienizado três vezes com ambos, um desinfetante e álcool. Para evitar que as córneas animais de secagem para fora, os olhos são lubrificados com uma pomada oftálmica (Vidisic) antes da cirurgia.
4. A incisão na pele é feita através da virilha direita aproximadamente ao nível do ligamento inguinal. Os vasos femorais são dissecados livre com cautério bipolar e dissecção romba; ramos profundos são ligados com 8-0 seda.
5. 300 ul (50 UI) de heparina são injetadas pela veia peniana de anti-coagulação.
6. Vasos femorais são ligadas ao nível do ligamento inguinal e cortou distal à ligadura.
7. Do membro posterior é lavada com gelado (4 ° C) solução HTK (5ml), através da artéria femoral mais de 5 minutos.
8. Todos os grupos musculares estão fortemente divididos com uma tesoura e osteotomia é realizada com uma tomada elétrica rotativa viu no nível do terço distal do fêmur.
9. O membro colhida é então imerso em 20 mL de solução gelada HTK para preservação e armazenamento a frio até o transplante.

Destinatário Operação e Transplante

1. O rato é anestesiados com injeção intraperitoneal de pentobarbital supina e colocado no campo de operação.
2. A incisão na pele é feita através da virilha direita aproximadamente ao nível do ligamento inguinal. Os vasos femorais são dissecados livre com cautério bipolar e dissecção romba.
3. Vasos femorais estão ligados o mais distal possível, mas proximal para a decolagem navio epigástrica. Pinças vasculares são colocados ao nível do ligamento inguinal na artéria e veia.
4. Um cuff de polietileno é puxado sobre a artéria (diâmetro interno cuff: 0,912 mm, espessura da parede cuff: 0,010 mm, comprimento do manguito: 2,0 mm) e veia (diâmetro interno cuff: 1,151 milímetros; manguito parede de espessura: 0,010 mm, comprimento do manguito : 2,0 mm). A borda do lúmen do vaso é então puxado com um vaso dilatador e da artéria femoral e da veia são evertido em todo o corpo do manguito (aproximadamente 2mm) e fixada com uma ligadura de seda circunferencial 8-0.
5. Para abrir espaço para o membro doador do membro receptor é removido com dissecção aguda de grupos musculares e osteotomia é realizada em meados da década de fêmur.
6. O membro doador é retirado da solução HTK e transplante começa com osteossíntese do fêmur usando uma agulha de calibre 18 (comprimento: 1.5-2.0 cm) como uma haste intramedular.
7. Grupos musculares ventrais estão intimamente aproximada com Vicryl 4-0 Prolene ou suturas interrompidas.
8. Anastomoses vasculares são realizadas por puxar a veia e artéria doadora sobre a veia destinatários e complexo manguito. A ligadura de seda 8-0 circunferencial é novamente colocada para proteger a anastomose.
9. O grampo venoso é liberado seguido pelo clamp arterial, e reperfusão é visualizado pelo retorno da cor ao membro distal e pé, bem como o fluxo pulsátil através da artéria.
10. Os restantes grupos musculares dorsais são re-aproximação com Vicryl 4-0 Prolene ou suturas interrompidas.
11. A pele é fechada com vicryl 4-0 ou prolene suturas interrompidas.
12. O rato destinatário é colocado sobre uma almofada de aquecimento e acompanhada de perto até a recuperação.
13. Animais destinatário receber antibiótico profilático (cefazolina, 20 mg / dia, IM) e Buprenex (0,1 mg / kg, SC) por três dias após o transplante.

Discussion

Décadas de pesquisa experimental e permitiu que o precederam transplante de mão bem-sucedido humanos no passado recente. Em 1978, Shapiro et al. desenvolveu um modelo de transplante ortotópico traseiras membro em ratos, bem adequado para estudar vários aspectos patológicos, fisiológicos e imunológicos, bem como o resultado funcional dos enxertos de tecido composto. Nós modificamos a parte mais desafiadora do processo, ou seja, a anastomose vascular, através da introdução de uma técnica não-cuff sutura. Quando comparada com a técnica de sutura convencional simplifica e encurta o procedimento cirúrgico e permite que os cirurgiões com experiência microcirúrgica básicas para realizar o procedimento com uma elevada taxa de sobrevivência (80-90%).

Sem a variabilidade das anastomoses suturadas, o risco de hemorragia, trombose e dobras do pedículo são diminuídas. Constrição ou turbulência no local onde o sangue inicialmente choca com a luz que passa através do manguito é um novo risco potencial da técnica manguito, embora isto pode ser minimizado com a seleção adequada do manguito de tamanho. Além disso, desencontros tamanho pequeno pode ser facilmente tratada com anastomose manguito, mais uma vez a redução do risco inerente à sutura vasos de diferentes diâmetros. Algumas das considerações mais importantes para uma anastomose manguito de sucesso são os seguintes:

1. Uma única injeção de Pentobarbital (50 IP mg / kg) deve ser suficiente para anestesiar o animal por 90 minutos. Caso a operação dure mais de 70-80 minutos uma dose adicional de 15mg/kg IP deve ser aplicada. Profundidade da anestesia pode ser testado no intra-operatório, repetindo o teste do dedo do pé pinch-reflex.
2. A osteotomia do doador membro membro / destinatário traseiras traseiras devem ser realizadas em meados da década de fêmur para aliviar a osteossíntese durante o transplante.
3. Uma seleção cuidadosa de tamanhos manguito é de importância crucial para a revascularização de sucesso.
4. Para evitar a trombose, heparina (50IU) deve ser administrada ao doador um minuto antes da perfusão do enxerto.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nembutal®	OVATION Pharmaceuticals
Heparin Immuno	Ebewe Pharma
Custodiol HTK Solution	Essential Pharmaceuticals
Adventitia Scissors	ASSI	ASSI®SAS-21 R-8T
Forceps	ASSI	ASSI®JFC-7
Dilator Forceps	ASSI	ASSI®D-5AZ
Polymide Tubes	River Tech Medical	#17; #19