Iniezione di Vene Portale: Un metodo per studiare la metastasi del cancro al fegato

Overview

Questo video descrive una procedura chirurgica per fornire cellule tumorali mammarie al fegato murino tramite iniezione di vena portale. Questo modello consente l'indagine delle fasi tardive della metastasi epatica.

Protocol

1. Preparazione dell'area chirurgica e degli strumenti

1. Preparare le forbici, le flessioni e l'emostato autoclave a 124 °C per 30 minuti, 1 - 2 giorni prima degli interventi chirurgici pianificati. Garantire l'accesso a biancheria da letto autoclavata o sterile, gabbie e cibo per il recupero post-chirurgico.
2. Preparare un'area chirurgica asettica, preferibilmente in una cappa a flusso laminare.
   1. Pulire tutte le superfici dell'area chirurgica con candeggina al 10%, tra cui il riscaldante, la fonte di luce, i tubi per anestesia e il cono del naso e qualsiasi altra parte della suite chirurgica che sarà nelle immediate vicinanze della procedura chirurgica durante l'esecuzione.
   2. Nell'area chirurgica aseptica, posizionare la pastiglia riscaldante pulita con drappo sterile, fonte di luce, tubi di anestesia e cono nasale, siringhe per insulina, siringhe da 1 ml, bupivacaina, lacrime artificiali, salina sterile, spugne di garza sterile da 2 x 2", garza sterile da 4 x 4", garza emostatica tagliata in pezzi da 0,5 - 1 cm2, forbici, pinze, emostato, suture vicriliche 4-0 con ago conico e 50 ml 2% gluconato di cloroesidina in un contenitore autoclavato.
   3. Assicurarsi che ci sia spazio in questo spazio per le cellule tumorali preparate conservate sul ghiaccio.
   4. Sulla panca adiacente all'area chirurgica, preparare l'area di recupero con una seconda pastiglia riscaldante e gabbie pulite con biancheria da letto sterile.
      NOTA: Questa zona può anche ospitare oggetti come uno sterilizzatore di perline.

2. Iniezione di vene portale

1. Un'ora prima delle iniezioni pianificate, trattare i topi femmine Balb/c di età compresa tra 8 e 15 settimane con 100 μl di 0,015 mg/ml di buprenorfina, per via sottocutanea, per la gestione del dolore.
   NOTA: Questo protocollo di iniezione può essere applicato a qualsiasi ceppo di topo femmina o maschio a qualsiasi età, utilizzando le linee cellulari appropriate per le modifiche al ceppo.
2. Preparare le cellule tumorali per l'iniezione sulla base di protocolli per la linea cellulare o l'espianto tumorale di scelta. Testare tutte le linee cellulari tumorali prima della somministrazione per la presenza di agenti patogeni murini per ridurre il rischio di introdurre tali agenti patogeni nella colonia animale.
   1. Per le linee cellulari tumorali balb/c sigeneiche tra cui cellule tumorali D2A1, D2.OR e 4T1, scongelare le cellule in una piastra di coltura tissutale di 10 cm 3 giorni prima dell'iniezione in modo che le cellule del giorno seguente siano a ~ 90 - 100% di confluenza.
   2. 1 giorno dopo il disgelo delle cellule tumorali le cellule di lavaggio una volta con 1x soluzione salina tamponata dal fosfato (PBS) e tripinare le cellule tumorali confluenti usando 2 ml di 0,05% di tripside a 37 °C per 5 minuti. Aggiungere 8 ml di mezzi completi (dmem alto glucosio, 10% siero bovino fetale, 2 mM L-glutammina e 1x penicillina/ streptomicina) e passare 1:10 in un piatto fresco da 10 cm con 10 ml di mezzi completi.
   3. Il giorno delle iniezioni, lavare le cellule una volta con 1x PBS e tripinare come descritto sopra.
   4. Resuspend cellule tripsinato in 8 ml di mezzi completi, girare per 5 minuti a 1.500 x g, rimuovere il supporto e rimossare in 5 ml 1x PBS.
   5. Contare le cellule su un emocitometro usando l'esclusione blu del tripano per la valutazione della fattibilità. Cellule resuspend per iniezione in 1x PBS a una concentrazione e un volume predeterminati.
      NOTA: Si raccomanda 5 - 10 μl poiché volumi di iniezione più piccoli prevengono danni inutili al fegato.
   6. Tenere le cellule sul ghiaccio per tutta la durata delle iniezioni. Dopo il completamento delle iniezioni, restituire un campione di cellule al laboratorio e posizionare in coltura in mezzi completi per 1 giorno per garantire la vitalità.
3. Posizionare il topo in anestesia con isoflurane 2 - 2,5% (2-cloro-2-(difluorometossi)-1,1,1-trifluoro-etano) erogato in ossigeno. Mantenere la temperatura corporea utilizzando la pastiglia riscaldante.  Assicurarsi l'anestesia completa valutando per una reazione a un dito del piedi, quindi mantenere l'anestesia al 2 - 2,5% di isoflurane.
   NOTA: È importante monitorare la frequenza respiratoria degli animali e regolare di conseguenza la portata dell'isoflurane durante tutta la procedura.
4. Posizionare una piccola quantità di lacrime artificiali o unguento veterinario su ogni occhio per evitare un'eccessiva asciugatura degli occhi durante la procedura chirurgica.
5. Posizionare il mouse in posizione supina, sulla schiena con l'addome esposto.
6. Rimuovere i capelli sul lato sinistro ventrale del roditore dal secondo spazio costola fino al 4 ° capezzolo della ghiandola mammaria inguinale pulendo l'area con depilatorio chimico. Lasciare riposare il depilatorio per 1 - 2 minuti e quindi rimuovere completamente con garza e H2O. Questo passaggio può essere eseguito con 1 - 2 giorni di anticipo per risparmiare tempo se sono previsti numerosi interventi chirurgici.
7. Prendere una spugna di garza sterile da 2 x 2" (imbevuta di 2% di clorexidina) e pulire il mouse nel sito di depilazione. Sterilizzare l'intera area circostante, compresa la coda, per ridurre al minimo la contaminazione batterica degli strumenti.
8. Pulire il sito di depilazione e l'area circostante con un tampone per la preparazione dell'alcol.
9. Ripetere ancora una volta il 2% di clorexidina e i passaggi di alcol e finire con una salvietta finale di clorexidina per un totale di tre lavaggi 2% di clorexidina e due lavaggi per tampone di preparazione dell'alcol. Fare la salvietta finale di clorexidina in modo tale che la sostanza chimica non gocciola intorno al sito chirurgico per evitare di ottenere clorexidina sugli organi interni.
   NOTA: L'applicazione di grandi quantità di clorexidina e alcol sulla pelle e sulla pelliccia circostante può comportare un calo significativo della temperatura corporea. Non pulire con volume in eccesso durante i passaggi 2.7-2.9. Mantenere la temperatura corporea con una pastiglia riscaldante.
10. Utilizzando guanti sterili e un bisturi sterilizzato con lama sterile, fare una singola incisione di 1 pollice nella pelle tra i piani mediano e sagittale sul lato sinistro del mouse, iniziando appena sotto le costole e terminando appena sopra il piano del quarto tettato della ghiandola mammaria inguinale.
11. Utilizzando forbici e forcep sterilizzate in autoclave o perline, fare un'incisione simile di 1 pollice nel peritoneo. Evitare di tagliare nel cuscinetto grasso mammario e assicurarsi di non tagliare l'intestino, il fegato o il diaframma.
12. Posizionare un cuscinetto di garza da 4 x 4" imbevuto di soluzione salina sterile sul lato sinistro del mouse, dove è stata effettuata l'incisione, in modo che gli organi interni possano essere posizionati sulla garza e non entrare in contatto con la pelle circostante o l'area chirurgica.
13. Preparare le cellule tumorali tubando su e giù più volte poiché le cellule tumorali si depositeranno durante la preparazione del topo. Preparare una siringa ad ago rimovibile da 25 μl e un ago calibro 32 con cellule tumorali. Spingere sulla siringa fino a quando le cellule tumorali non sono sulla punta dell'ago e lo stantuffo è al volume appropriato per l'iniezione; evitare l'iniezione di bolle d'aria.
14. Pulire l'esterno dell'ago con un tampone alcolico sterile per rimuovere eventuali cellule tumorali esterne. Prestare attenzione per evitare bastoncini d'ago.
15. Tenere il lato mediano dell'incisione, compresa la pelle e il rivestimento peritoneale, a parte con le forcep e utilizzare un batuffolo di cotone sterile per estrarre con cura l'intestino crasso e tenue, posizionandoli sulla garza sterile imbevuta di soluzione salina sterile. Estrarre l'intestino crasso e tenue fino a visualizzare la vena porta.
16. Coprire gli organi interni nella garza imbevuta salina per mantenere l'umidità interna e la sterilità.
17. Avere un assistente, che indossa anche guanti sterili, tenere l'intestino avvolto nella garza salina imbevuta delicatamente fuori mano con un tampone sterile con punta di cotone per rivelare completamente la vena del portale. Inoltre, potrebbe essere necessario utilizzare l'emostato autoclavato o le forceps per tenere da parte il tessuto sul lato mediano dell'incisione.
18. Inserire l'ago caricato con cellule tumorali ~ 3 - 5 mm nella vena porta ~ 10 mm sotto il fegato con un angolo < 5° rispetto alla vena, con smussatura rivolta verso l'alto. Iniettare lentamente l'intero volume contenente cellule tumorali. Lasciare scorrere il sangue oltre la testa dell'ago per diversi secondi per evitare il flusso posteriore delle cellule tumorali dalla vena. Ridurre al minimo lo spostamento dell'ago nella vena durante l'iniezione. Ancora una volta, prestare attenzione per evitare bastoncini d'ago.
    NOTA: La visualizzazione della vena del portale viene eseguita senza ingrandimento, tuttavia un microscopio stereo può essere utilizzato se preferito.
19. Rimuovere l'ago posizionando contemporaneamente un applicatore sterile della punta di cotone sulla vena con pressione. Con l'assistente che tiene ancora da parte l'intestino, posizionare un pezzo di garza emostatica da 0,5 a 1 cm2 sul sito di iniezione sulla vena.
    NOTA: Anche la polvere emostatica è stata tentata per questo passaggio del protocollo, ma non è stata efficace nell'arrestare la perdita di sangue venoso dopo l'iniezione.
20. Tenere la garza emostatica nel sito di iniezione con la pressione di un applicatore sterile della punta di cotone per 5 minuti.
21. Valutare la chiusura della vena sollevando attentamente la garza emostatica, se la garza si attacca al tessuto circostante, una piccola quantità di soluzione salina sterile può essere utilizzata per immergere e sollevare la garza.
22. Se la perdita di sangue si verifica in questo momento, posizionare un ulteriore pezzo di garza emostatica nel sito con pressione per altri 5 minuti. Quando il flusso sanguigno è cessato completamente, rimuovere la garza dal topo.
    NOTA: La perdita di sangue durante la procedura chirurgica deve essere attentamente valutata e se il volume totale consentito di perdita di sangue viene soddisfatto o superato (in base alle procedure operative standard normative per le commissioni di revisione istituzionali dello sperimentatore) il topo deve essere eutanasiato durante l'anestesia per perfusione cardiaca.
23. Una volta che il sito di iniezione è considerato intatto, senza che il sangue lasci il sito di iniezione, riposizionare delicatamente gli organi interni nella cavità addominale.
24. Suturare il rivestimento peritoneale e quindi la pelle con sutura sterile 4-0 vicril e ago conico utilizzando un semplice modello di sutura continua o interrotta. In genere, la chiusura dell'incisione richiede 10-15 suture.
25. Iniettare 100 μl di bupivacaina (5 mg/ml) lungo il sito di incisione per la gestione locale del dolore utilizzando una siringa per insulina. Iniettare 0,5 ml di soluzione salina sterile per via sottocutanea utilizzando una siringa da 1 ml con ago calibro 26 per l'idratazione. Gli interventi chirurgici devono essere completati da 15 a 25 minuti.
26. Per mantenere condizioni sterili durante l'intervento chirurgico, assicurarsi che tutti gli strumenti e i materiali che entrano in contatto con il mouse, comprese le mani guantate, vengano puliti in modo appropriato prima del contatto. Ove possibile, utilizzare materiali e guanti sterili o utilizzare minimamente una soluzione di etanolo al 70% o una soluzione di candeggina al 10% per pulire.
27. Se sono previsti interventi chirurgici multipli per una singola sessione, rifare l'area chirurgica iniziale con drappo sterile fresco, siringhe per insulina, siringhe da 1 ml, salina sterile, spugne di garza sterile da 2 x 2", garza sterile da 4 x 4", garza emostatica tagliata in pezzi da 0,5 - 1 cm2, suture di vicril 4-0 con ago conico e 2% di clorexidina. Sterilizzare le forbici, le forcep e l'emostato tra un intervento chirurgico e l'altro e lasciare raffreddare adeguatamente prima del nuovo utilizzo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle	BD Syringe	309597	309597
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62	For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile	Kendall	8044	4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears	Rugby	370114	Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml	Mfg. by Reckitt Benckiser	NDC-12496-0757-1	Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml)	Mfg. by Humira Inc	NDC-04091163-01	Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze	Medtrade Products Ltd.	FG08839011	Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chlorhexidine, 2% Solution	Vet One	1CHL008	Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
Cotton Tipped Applicators, Sterile	Fisher Scientific	23-400-114	6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose	HyClone	SH30243.01	Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer			Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution			Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2016 Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License Page 2 of 3 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile	Kendall	2146	2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
Isoflurane	Piramal	NDC-66794-017-25	Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	911103	Use caution, vaporizes anesthetic gases
Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702	Hamilton	7654-01	For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle			Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15			Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge	Hamilton	7803-04	For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34- gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sterile Saline	Fisher Scientific	BP358-212	0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile			Multiple suppliers
Sutures, Sterile	Ethicon	J310H	4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine	VetEquip	901801	Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps			Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile	Dynarex	4410	18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery