Portal Vene injeksjon: En metode for å studere kreftmetastase til leveren

Overview

Denne videoen beskriver en kirurgisk prosedyre for å levere mammary tumorceller til murin leveren via portal vene injeksjon. Denne modellen tillater undersøkelse av sene stadier av levermetastase.

Protocol

1. Utarbeidelse av kirurgisk område og instrumenter

1. Forbered saks, tang og hemostat ved autoklavering ved 124 °C i 30 minutter, 1 - 2 dager før de planlagte operasjonene. Sørg for tilgang til autoklavert eller sterilt sengetøy, bur og mat for postkirurgisk gjenoppretting.
2. Forbered et aseptisk kirurgisk område, helst i en laminær strømningshette.
   1. Tørk av alle overflater av det kirurgiske området med 10% blekemiddel, inkludert varmeputen, lyskilden, anestesirør og nesekjegle, og andre deler av den kirurgiske suiten som vil være i nærheten av den kirurgiske prosedyren mens den utføres.
   2. I det aseptiske kirurgiske området plasserer du den rensede varmeputen med steril gardin, lyskilde, anestesirør og nosecone, insulinsprøyter, 1 ml sprøyter, bupivacaine, kunstige tårer, steril saltløsning, 2 x 2" sterile gasbindsvamper, 4 x 4" steril gasbind, hemostatisk gasbind kuttet i 0,5 - 1 cm2 stykker, saks, tang, hemostat, 4-0 vicryl suturer med konisk nål og 50 ml 2% klorhexidin glukonat i en autoklavert beholder.
   3. Forsikre deg om at det er plass i dette rommet til forberedte tumorceller lagret på is.
   4. På benken ved siden av det kirurgiske området, forbered gjenopprettingsområdet med en annen varmepute og rengjør bur med sterilt sengetøy.
      MERK: Dette området kan også huse gjenstander som en perlesterilisator.

2. Portal vene injeksjon

1. En time før de planlagte injeksjonene, behandle Balb / c kvinnelige mus i alderen 8 - 15 uker med 100 μl 0,015 mg / ml buprenorfin, subkutant, for smertebehandling.
   MERK: Denne injeksjonsprotokollen kan påføres enhver stamme av kvinnelig eller mannlig mus i alle aldre, ved hjelp av de aktuelle cellelinjene for endringer i belastningen.
2. Forbered tumorcellene til injeksjon basert på protokoller for cellelinjen eller svulsten utvisning av valg. Test alle tumorcellelinjer før administrering for tilstedeværelse av murinpatogener for å redusere risikoen for å introdusere slike patogener i dyrekolonien.
   1. For syngeneic Balb/c tumorcellelinjer inkludert D2A1, D2.OR og 4T1 tumorceller, tine celler i en 10 cm vevskulturplate 3 dager før injeksjon slik at følgende dagceller er på ~ 90 - 100% samløp.
   2. 1 dag etter at tumorcellen tiner vaskeceller en gang med 1x fosfatbufret saltvann (PBS) og prøver å innfelle de sammenføyende tumorcellene ved hjelp av 2 ml 0,05% trypsin ved 37 °C i 5 minutter. Tilsett 8 ml komplette medier (DMEM høy glukose, 10% foster bovint serum, 2 mM L-glutamin og 1x penicillin/streptomycin) og passasje 1:10 i en frisk 10 cm tallerken med 10 ml komplette medier.
   3. På injeksjonsdagen vasker du celler en gang med 1x PBS og prøver som beskrevet ovenfor.
   4. Resuspend trypsiniserte celler i 8 ml komplette medier, spinn i 5 min ved 1500 x g, fjern mediet og resuspend i 5 ml 1x PBS.
   5. Tell celler på et hemocytometer ved hjelp av trypan blå ekskludering for levedyktighetsvurdering. Resuspend celler til injeksjon i 1x PBS ved en forhåndsbestemt konsentrasjon og volum.
      MERK: 5 - 10 μl anbefales da mindre injeksjonsvolumer forhindrer unødvendig skade på leveren.
   6. Hold celler på is så lenge injeksjonene varer. Etter ferdigstillelse av injeksjoner, returner en prøve av celler til laboratoriet og plasser i kultur i komplette medier i 1 dag for å sikre levedyktighet.
3. Plasser musen under anestesi med 2 - 2,5% isofluran (2-klor-2-(difluorometoksy)-1,1,1-trifluoro-etan) levert i oksygen. Oppretthold kroppstemperaturen ved hjelp av varmeputen.  Sørg for fullstendig bedøvelse ved å vurdere for en reaksjon på en tåklemme, og oppretthold deretter anestesi ved 2 - 2,5% isofluran.
   MERK: Det er viktig å overvåke dyrenes pustehastighet og justere isofluranstrømningshastigheten tilsvarende gjennom hele prosedyren.
4. Legg en liten mengde kunstige tårer eller veterinærsalve over hvert øye for å unngå overdreven tørking av øynene under den kirurgiske prosedyren.
5. Plasser musen i en liggende stilling, på ryggen med magen utsatt.
6. Fjern hår på gnagerens ventrale venstre side fra det andre ribberommet ned til den fjerde inguinale brystkjertelnippelen ved å tørke av området med kjemisk depilatorium. La depilatoriet sitte i 1 - 2 min og fjern deretter helt med gasbind og H2O. Dette trinnet kan gjøres 1 - 2 dager i forveien for å spare tid hvis mange operasjoner er planlagt.
7. Ta en 2 x 2" steril gasbindsvamp (gjennomvåt i 2% klorhexidin) og tørk av musen på stedet for hårfjerning. Steriliser hele området, inkludert halen, for å minimere bakteriell forurensning av instrumenter.
8. Tørk av stedet for hårfjerning og området rundt ned med en alkohol prep pad.
9. Gjenta 2% Klorhexidin og alkohol trinn igjen og avslutt med en endelig Klorhexidin tørke ned for totalt tre 2% Klorhexidin og to alkohol prep pad vasker. Gjør den endelige Klorhexidin tørk slik at kjemikaliet ikke drypper rundt operasjonsstedet for å unngå å få klorhexidin på indre organer.
   MERK: Påføring av store mengder klorhexidin og alkohol til huden og omkringliggende pels kan føre til en betydelig nedgang i kroppstemperaturen. Ikke tørk av med overflødig volum i trinn 2.7-2.9. Opprettholde kroppstemperatur med en varmepute.
10. Bruk sterile hansker og en sterilisert skalpell med sterilt blad, gjør et enkelt 1-tommers snitt inn i huden mellom median- og sagittalplanene på venstre side av musen, starter like under ribbenene og slutter like over planet til den fjerde inguinale brystkjertelen.
11. Bruk autoklaved eller perle sterilisert saks og tang, gjør et lignende 1-tommers snitt inn i bukhinnen. Unngå å kutte inn i mammaryfettputen og sørg for ikke å kutte tarmene, leveren eller membranen.
12. Plasser en 4 x 4" gasbindpute gjennomvåt i steril saltvann på venstre side av musen, hvor snittet ble gjort, slik at indre organer kan plasseres på gasbindet og ikke komme i kontakt med omkringliggende hud eller kirurgisk område.
13. Forbered tumorceller ved å pipettere opp og ned flere ganger, da tumorceller vil bosette seg under forberedelsen av musen. Forbered en 25 μl avtagbar nål sprøyte og 32-gauge nål med tumorceller. Trykk på sprøyten til tumorcellene er på spissen av nålen og stempelet er på riktig volum for injeksjon; unngå injeksjon av luftbobler.
14. Tørk av utsiden av nålen med en steril alkoholpute for å fjerne eventuelle eksterne tumorceller. Vær forsiktig for å unngå nålestikk.
15. Hold mediansiden av snittet, inkludert hud og bukfôr, til side med tang og bruk en steril bomullspinne for å forsiktig trekke ut store og små tarmer, og plasser dem på den sterile gasbind gjennomvåt i steril saltvann. Trekk ut store og tynntarmene til portalvenen er visualisert.
16. Dekk de indre organene i saltvanns gjennomvåt gasbind for å opprettholde indre fuktighet og sterilitet.
17. Ha en assistent, også iført sterile hansker, hold tarmene innpakket i saltvanns gjennomvåt gasbind forsiktig ut av veien med en steril bomullsspisset vattpinne for å avsløre portalvenen helt. I tillegg kan det være nødvendig å bruke autoklaved hemostat eller tang for å holde vevet til side på mediansiden av snittet.
18. Sett nålen lastet med tumorceller ~ 3 - 5 mm inn i portalvenen ~ 10 mm under leveren i en vinkel < 5° til venen, med skråkant vendt opp. Injiser sakte hele volumet som inneholder tumorceller. La blodet strømme forbi nålehodet i flere sekunder for å unngå tilbakestrømning av tumorceller ut av venen. Minimer flytting av kanylen i venen under injeksjonen. Igjen, vær forsiktig for å unngå nålepinner.
    MERK: Visualisering av portalvenen gjøres uten forstørrelse, men et stereomikroskop kan brukes hvis ønskelig.
19. Fjern nålen samtidig som du plasserer en steril bomullsspissapplikator på venen med trykk. Med assistenten som fortsatt holder tarmene til side, plasser ett stykke 0,5 - 1 cm2 hemostatisk gasbind over injeksjonsstedet på venen.
    MERK: Hemostatisk pulver ble også forsøkt for dette trinnet i protokollen, men var ikke effektiv i å stoppe venøst blodtap etter injeksjon.
20. Hold hemostatisk gasbind på injeksjonsstedet med trykk fra en steril bomullsspissapplikator i 5 min.
21. Vurder lukking av venen ved å forsiktig løfte hemostatisk gasbind, hvis gasbind stikker til det omkringliggende vevet, kan en liten mengde steril saltvann brukes til å suge og løfte gasbindet.
22. Hvis blodtap oppstår på dette tidspunktet, plasser et ekstra stykke hemostatisk gasbind på stedet med trykk i ytterligere 5 min. Når blodstrømmen har opphørt helt, fjern gasbindet fra musen.
    MERK: Blodtap under kirurgisk prosedyre må vurderes nøye, og hvis det totale tillatte blodtapsvolumet er oppfylt eller overskredet (basert på regulatoriske standard driftsprosedyrer for undersøkerens institusjonelle gjennomgangstavler), må musen avlives mens den er under anestesi ved hjerteperfusjon.
23. Når injeksjonsstedet anses som intakt, uten at blod forlater injeksjonsstedet, plasser de indre organene forsiktig tilbake i bukhulen.
24. Suturer bukfôret og deretter huden med steril 4-0 vicryl sutur og konisk nål ved hjelp av et enkelt kontinuerlig eller avbrutt suturmønster. Vanligvis krever lukking av snittet 10-15 suturer.
25. Injiser 100 μl bupivakain (5 mg/ml) langs snittstedet for lokal smertebehandling ved hjelp av en insulinsprøyte. Injiser 0,5 ml steril saltvann subkutant ved hjelp av en 1 ml sprøyte med 26-gauge nål for hydrering. Operasjoner tar 15 - 25 min å fullføre.
26. For å opprettholde sterile forhold gjennom hele operasjonen, må du sørge for at alle verktøy og materialer som kommer i kontakt med musen, inkludert hanskede hender, rengjøres på riktig måte før kontakt. Der det er mulig, bruk sterile materialer og hansker, eller bruk minimalt en 70% etanoloppløsning eller 10% blekemiddelløsning for rengjøring.
27. Hvis flere operasjoner er planlagt for en enkelt økt remake det første kirurgiske området med friske sterile draper, insulin sprøyter, 1 ml sprøyter, steril saltløsning, 2 x 2 " sterile gasbind svamper, 4 x 4 " steril gasbind, hemostatisk gasbind kuttet i 0,5 - 1 cm2 stykker, 4-0 vicryl sutures med konisk nål, og 2% Klorhexidin. Perlesteriliser saksen, tangen og hemostaten mellom operasjoner og la den avkjøles tilstrekkelig før gjenbruk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle	BD Syringe	309597	309597
Alcohol Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-62	For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile	Kendall	8044	4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears	Rugby	370114	Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml	Mfg. by Reckitt Benckiser	NDC-12496-0757-1	Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml)	Mfg. by Humira Inc	NDC-04091163-01	Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze	Medtrade Products Ltd.	FG08839011	Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chlorhexidine, 2% Solution	Vet One	1CHL008	Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
Cotton Tipped Applicators, Sterile	Fisher Scientific	23-400-114	6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose	HyClone	SH30243.01	Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer			Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution			Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03	Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2016 Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported License Page 2 of 3 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile	Kendall	2146	2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
Isoflurane	Piramal	NDC-66794-017-25	Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	911103	Use caution, vaporizes anesthetic gases
Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702	Hamilton	7654-01	For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle			Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15			Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge	Hamilton	7803-04	For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34- gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sterile Saline	Fisher Scientific	BP358-212	0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile			Multiple suppliers
Sutures, Sterile	Ethicon	J310H	4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine	VetEquip	901801	Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps			Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile	Dynarex	4410	18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery