Summary
DNA stabil-isotop sondering är en odlings-oberoende metod för att identifiera och karakterisera aktiva samhällen av mikroorganismer som kan utnyttja vissa substrat. Assimilering av substrat anrikat med tunga isotop leder till inkorporering av märkta atomer till mikrobiell biomassa. Densitetsgradient ultracentrifugering hämtar märkt DNA för nedströms molekylära analyser.
Abstract
DNA stabil-isotopen sondering (DNA-SIP) är en kraftfull teknik för att identifiera aktiva mikroorganismer som tillgodogöra sig särskilt kol substrat och näringsämnen till cellulära biomassa. Som sådan har denna odling är oberoende av tekniken varit en viktig metod för att tilldela metabolisk funktion i olika samhällen lever ett brett utbud av terrestra och akvatiska miljöer. Efter inkubering av en miljö-prov med stabil-isotop märkt föreningar utvinns nukleinsyra utsatts för densitetsgradient ultracentrifugering och efterföljande lutning fraktionering att separera nukleinsyror av olika densitet. Rening av DNA från cesiumklorid hämtar märkta och omärkta DNA för efterföljande molekylär karakterisering (t.ex. fingeravtryck, mikroarrayer, klon bibliotek, metagenomik). Detta JUPITER video-protokollet ger visuell steg-för-steg förklaringar av protokollet för densitetsgradient ultracentrifugering, lutning fraktionering och återvinning av märkta DNA. Protokollet innehåller också exempel SIP data och belyser viktiga tips och varningar som måste beaktas för att säkerställa en framgångsrik DNA-SIP-analys.
Protocol
1. Beredning av reagenser
DNA-SIP kräver användning av reagenser som bör förberedas före själva förfarandet. Anvisningarna för beredning av varje reagens anges i detta avsnitt och ändras från en tidigare SIP-protokollet 1.
- Cesiumklorid (CsCl) lösning för att förbereda SIP lutningar - Förbered en 7,163 M CsCl lösning genom att gradvis lösa upp 603,0 g CsCl i destillerat och avjoniserat vatten (DDH 2 O) till en slutlig volym på 500 ml. Var noga med att inte överstiga 500 ml! Uppvärmningen lösningen svagt under omrörning hjälper upplösa alla CsCl. Alikvotera den slutliga lösningen i slutna alikvoter. I vårt labb, är en gemensam lagring praxis att förbereda 100-ml-portioner i 125-mL serum flaskor, som sedan crimp förslutna med butylgummipropp. Den förseglade alikvoter kan förvaras under obegränsad tid vid rumstemperatur (20 ° C). Tätningarna förhindra avdunstning och CsCl "crust" bildas. Bestäm densiteten av lösningen genom att väga tre exemplar 100-mikroliter alikvoter, eller genom att använda en digital refraktometer (t.ex. Reichert AR200) som har noggrant kalibrerade för CsCl lösningar. När kalibreras korrekt, Reichert AR200 konsekvent och ger noggranna avläsningar under flera år. Vid rumstemperatur (20 ° C), varierar den slutliga densitet av denna lösning typiskt 1,88 till 1,89 g ml -1. Densiteten varierar något varje gång ett nytt bestånd är beredd.
- Cesiumkloridlösning för att förbereda övertoningar med etidiumbromid (EtBr) - Kombinera 250 g CsCl med 250 ml steril DDH 2 O vatten. Alikvot denna lösning i separata serum injektionsflaskor som har crimp förslutna med butyl gummitätningar som beskrivs i 1.1.
- Gradient Buffer - Kombinera 50 ml 1 M Tris-HCl, 3,75 g KCl och 1 ml 0,5 M EDTA till 400 ml vatten. Lös KCl, lägg sedan till DDH 2 O till 500 ml. Filter-sterilisera och autoklav. Den slutliga lösningen är 0,1 M Tris, 0,1 M KCl och 1 mM EDTA.
- Polyetylenglykol (PEG) lösning - Bered PEG-lösning genom att lösa 150 g polyetylenglykol 6000 och 46,8 g NaCl i sterila DDH 2 O vatten till en total volym av 500 ml (30% PEG, 1,6 M NaCl). Autoklav.
Observera: Denna lösning separerar i två faser med autoklavering. Inkludera en omrörare i autoklaveras flaskan så att lösningen på rätt sätt kan blandas när detta inträffar. - TE buffert - Förbered en lösning på 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) och 1 mM EDTA (pH 8,0) i sterilt DDH 2 O vatten med autoklaveras stamlösningar 1 M Tris-HCl (pH 8,0) och 0,5 M EDTA ( pH 8,0). Filtrera sterilisera och autoklav.
- 70% etanol - Kombinera 350 ml av hög renhet etanol med 150 ml sterilt DDH 2 O vatten.
2. Exempel Ruvning och DNA-extraktion
För DNA-SIP inkubationer, prover vanligtvis inkuberas med tunga isotopen kol (13 C) substrat. Inkubationstid och förhållanden (t.ex. näringsämnen tillskott, fukt, ljus) varierar beroende på vilken typ av urval som inkuberas och vilken typ av substrat. DNA-SIP experiment har utförts med godkänt resultat med hjälp av olika enda kolföreningar 2,3, multi-kolföreningar 4,5,6, och med hjälp märkt kväve 7,8 eller syre 9. Det är dock en nackdelen med att använda 15 N-eller 18 O-märkta föreningar minskad fysisk separation mellan märkta nukleinsyra, främst på grund av förekomsten av mindre kväve-och syreatomer i DNA och RNA i förhållande till kolatomer.
En kritisk kontroll för DNA-SIP experiment är en identisk inkubation etablerats med infödda (t.ex. 12 C) substrat. Detta inkubation ger en efterföljande jämförelse att se till att uppenbara märkning av nukleinsyra var inte en artefakt av ultracentrifugering eller G + C innehåll skillnader densiteten i DNA bidrar till separation 10. Det är också viktigt att hålla fryst provmaterial för jämförelse med "lätt" och "tunga" DNA, och värt inklusive en no-substrat kontroll för att bedöma förändringar bakgrunden befolkningen i hela SIP inkubation.
- Inkubera miljöprover i mikrokosmos innehåller märkta substrat (figur 1). Enligt vår erfarenhet har vi funnit att minst införlivandet av mellan 500-500 mikromol av 13 C koldioxid per gram prov kommer att vara lämpliga för prover som innehåller hög biomassa som jordprover 1. För vattenlevande prover som innehåller mindre biomassa än jordar, kan 100-100 mikromol av aktiebolag 13 C koldioxid per liter ger en detekterbar tung isotop signatur 1. Den mängd koldioxid ändring kommer andelen kol ingår i biomassa och krav på kompletterande näringsämnen tillägg för assimilering är alla beroende av egenskaperna hos de prover som analyseras och riktade organisms av intresse. En enda uppsättning riktlinjer prov inkubation kommer inte att gälla för alla prover. Viktigt bör substrat koncentration som används för SIP inkubering helst vara så nära som möjligt till koncentrationen normalt i situ, experimentell partiskhet kan vara en följd av förhållanden berikande kultur 10.
- Efter inkubering av provet med en stabil-isotop märkta substrat, extrahera DNA från mikrokosmos med hjälp av en rigorös extraktion protokoll (för PCR eller små in kloning) eller en betrodd enzymatisk lysering för hög molekylvikt kloning (t.ex. stora Sätt metagenomik). RNA co-extraktion i allmänhet inte påverkar analysen, så protokoll som ger RNA samt DNA kan användas. Den ultracentrifugering av extraherat DNA kommer inte att klippa fragment kortare än ~ 50 kb par 1.
- Kvantifiera extraherade DNA innan installationen av CsCl rören lutning ultracentrifugering. Kvantifiera DNA med hjälp av en spektrofotometer (t.ex. Nanodrop 2000), om utvinningen protokollet ger bara DNA (t.ex. kolumn-baserade byggsatser). Alternativt kvantifiera med agarosgelelektrofores.
3. Förbereda Gradient Lösningar för ultracentrifugering
Detta förfarande innebär att lägga DNA ultracentrifugen rör. Det finns mer än en typ av rör och rotorn så exakt protokollet kommer att variera och beror på tillverkarens anvisningar. Som sagt, rekommenderar vi användning av en vertikal och rotor för att säkerställa högsta möjliga separation av lätta och tunga DNA. Vi använder en Beckman-Coulter Vti 65,2 rotor med 16 brunnar för att hålla 5,1 ml QuickSeal Polyallomer rör och protokollet kommer att ge steg och överväganden för dessa förhållanden.
- Med hjälp av DNA-koncentrationer som fastställs i steg 2,3, beräkna erforderlig volym extraherat DNA som krävs för att ge 0,5 mikrogram - 5 mikrogram av DNA i ultracentrifugen rör.
- Kombinera extraherat DNA (0,5 - 5 mikrog) med Gradient Buffer (se steg 1,3) och 4,8 ml 7,163 M CsCl till en total volym på ~ 6 ml i en steril 15 ml-rör. Observera att densitet CsCl lösningen kan variera även på samma molaritet (se steg 1.1). Följande ekvation kan användas för att fastställa omfattningen av Gradient Buffer / DNA-blandning som krävs för att generera en lämplig blandningsförhållande:
Gradient buffert och DNA-lösning volym (ml) = (CsCl stamlösning densitet - önskade slutliga densitet) x volym CsCl stamlösning läggas x 1,52
Ange volym CsCl stamlösning på 4,80 ml. Den önskade slutliga densitet bör vara 1,725 g ml -1. Stamlösningen densitet bestämdes i steg 1,1.
Observera också att den relativa volymer CsCl och lutning Buffer / DNA kommer att resultera i en kombinerad volym större än 5,1 ml. Förbereda volymer större än den maximala volymen kapacitet ultracentrifugen rören (större än 5,1 ml) kommer att säkerställa att det finns tillräckligt med lösning för att helt fylla röret. - Blanda genom att vända 10 gånger. DNA är stabilt i rumstemperatur i CsCl.
4. Skapa ett EtBr kontroll Gradient (tillval)
Eftersom EtBr är en intercalating färgämne som komplex med DNA som gör det synligt i UV-belysning, styr-toningar innehåller EtBr är användbara eftersom de ger omedelbar visuell bekräftelse av gradient bildas innan fraktionering av provrör (t.ex. figur 1). Införandet av ett kontroll rör som innehåller EtBr och en blandning av båda 12 C-DNA och 13 C-DNA (eller 14 N-DNA och 15 N-DNA) möjliggör omedelbar visualisering av band bildas i rören efter avslutad ultracentrifugering. Detta är viktigt eftersom en brusten röret under ultracentrifugering eller felaktigt programmerad villkor springa kan resultera i misslyckade gradient bildas. Binds till DNA, sänker EtBr tätheten av DNA och som ett resultat, är ett annat protokoll följas för att förbereda gradienter. Observera att andra nukleinsyra fläckar kan användas i stället för EtBr 11 men protokollet kräver optimering med andra fluoroforer.
- Kontrollen lutning kräver två volymer av arvsmassans DNA: en helt märkta med stabila-isotop och en utan etikett. Vi använder vanligtvis antingen Sinorhizobium meliloti odlas i media som innehåller 13 C-eller 12 C-glukos som enda kolkälla, eller Methylococcus capsulatus stam Bath odlade i närvaro av 13 C-eller 12 C-metan som våra kontroller.
- Kombinera en 5 -10 mikrogram mängd av både 12 C-DNA och 13 C-DNA med Gradient buffert till en slutlig volym av 1,00 ml i en engångs 15-ml skruvkork rör.
- Tillsätt 1,00 g fast CsCl till samma rör. Blanda genom inversion.
- Tillsätt 110 lav en 10 mg ml -1 EtBr lösning och 4,3 ml av en 1 g ml -1 CsCl stamlösning till samma skruvkork rör används i steg 4,2. Den slutliga densitet lösningen kommer ungefärliga den ursprungliga CsCl stamlösning.
- En ytterligare "blank" kontroll lösning innehållande EtBr kommer också att krävas för att uppväga den lösning som skapades i steg 4.4. Kombinera 1,00 ml Toning buffert, 1,00 g CsCl, 110 l av en 10 mg ml -1 EtBr lösning och 4,3 ml av en 1 g ml -1 CsCl stamlösning i en separat 15 ml skruvkork röret och blanda genom inversion.
5. Ultracentrifugering
- Med hjälp av en glödlampa och pasteurpipett, noggrant fylla ultracentrifugen rör med lutning som bereds på steg 3,2 (eller steg 4,4 om att förbereda en EtBr kontroll gradient). Tillsätt försiktigt lösningarna på rören med hjälp av en pasteurpipett. Märk rören på röret axeln med en fin permanent märkpenna. VARNING: Se till att rören fylls precis till basen av röret halsen. Otillräckligt fyllda rör är sannolikt att brista under ultracentrifugering.
- När alla nödvändiga rören är fyllda med prov-lösningar, spela in den exakta massan av varje rör. Par rör och balansen dem att inom 0-10 mg. För att balansera, hitta nästan matchade par och lägga till eller ta bort små mängder av lösning tills de är balanserade, hålla lösningen nivå så nära botten av röret halsen som möjligt. Observera att för vägning rör, använder vi en inverterad 15-ml skruvkork röret som har halverats som en slang hållare för balansen.
- Täta rör med en "tube topper" enligt tillverkarens anvisningar.
- Kontrollera att rören är ordentligt tätade genom att vända dem och tillämpa måttligt tryck. Väg rören igen för att kontrollera att de fortfarande är balanserade efter tätning till inom 0-10 mg.
- Kontrollera varje rotor och noggrant för att säkerställa att brunnarna är rena och fria från skräp och damm som kan punktera rören under ultracentrifugering.
- Sätt in rören i rotorn med en balanserad par mitt emot varandra. Spela in rotorn platsen för varje prov, eftersom ultracentrifugering process kan orsaka markör etiketter som skall skadas eller raderas. Täta omsorgsfullt rotorn brunnar som anges av tillverkaren.
- Ladda rotorn in i ultracentrifugen. Stäng ultracentrifugen dörren och tillämpa ett vakuum. Om du använder en Vti 65,2 rotor, ställa in rotationshastigheten till 44.100 rpm (~ 177 tusen xg AV), temperaturen på 20 ° C, och ultracentrifugering tid för 36-40 timmar. Välj vakuum, maximal acceleration och stänga av bromsen (ser lutning inte störs av retardation). Observera att stänga av bromsen kommer att lägga till en ytterligare 1-2 timmar till körningen. Observera också att kortare sikt ibland inte kan uppnå tillräcklig bandet upplösning. Långa ultracentrifugering körningar rekommenderas, eftersom de leder till högre upplösning av distinkta nukleinsyra band.
- Omedelbart efter slutförandet av ultracentrifugering förfarande, ta bort rotorn noggrant. Undvika tippning eller stöta på rotorn, försiktigt bort rören från rotorn för att undvika att störa gradienter i rören. I sällsynta fall kan ett rör sönder under körning. Om så är fallet, finns det en chans att övertoningar i de övriga rören inte formen ordentligt. Om en kontroll lutning ingick, kontrollera detta rör noggrant under UV-ljus för att bekräfta gradient bildas. Om lutningen inte har bildat korrekt i kontrollen röret, är det bäst att upprepa alla steg 5. Observera att EtBr kontroll röret och dess tomt kontroll kan förvaras mörkt och återanvändas upp till sex månader. Var noga med att rengöra rotorn noggrant enligt tillverkarens anvisningar när brast röret har tagits bort. Använd inte metallborstar eller slipande rengöringsmedel för att rengöra rotorn brunnar för att undvika repor på rotorn brunnar! Rotor-specifika borstar och rengöringsmedel kan köpas från Beckman.
6. Gradient Fraktionering
Det finns två metoder som idag används för att återhämta sig DNA från ultracentrifugen rör: fraktionering och nål extraktion. Detta protokoll kommer bara att beskriva processen att utvinna DNA med fraktionering teknik. Detta beror på att för de flesta SIP-experiment, kan märkas DNA inte kan visualiseras med EtBr och måste istället upptäckas genom att jämföra motsvarande lätta och tunga fraktioner från flera provrör. Sprutpump rekommenderas starkt att hämta lika fraktioner densitetsgradient från ultracentrifugen rör. Vi använder en BSP pumpmodell infusion (Braintree Scientific Inc.). En låg-flöde Slangpumpar eller en HPLC-pump kan också användas.
- Fyll en steril 60 ml spruta med steril DDH 2 O innehåller tillräckligt Bromfenolblått färgämne för att ge en mörkblå färg. Lägg sprutan om lastning arm sprutpump.Fäst pumpens slang försedd med en 23-gauge 1 "nål och slå på pumpen tills några DDH 2 O har kommit fram till slutet av nålen. Observera att eventuella luftbubblor i den här DDH 2 O utbudet negativt kommer att påverka fraktioneringsprocess.
- Fäst ett av de ultracentrifugering rör till en klämma monter. Se till att klämman är tillräckligt tät för att hindra röret från att vara på flykt, men inte så att trycket på tuben skulle orsaka en frisättning av CsCl lösning när röret är perforerad. Stick hål på botten av röret längs röret sömmen med en ny 23 gauge 1 "nål. För bästa resultat, hål i röret i en kontrollerad, snabb och säker sätt. Detta är mycket svårt att göra bra, öva flera gånger innan detta först försökte med provrören.
- För varje prov, förbereda 12 sterila 1,5 ml rör mikrocentrifug med etiketter som anger provet antal och andel (1-12, tunga för ljus). Använda nålen bifogas pumpslang (steg 6,1), hål i toppen av röret på det övre röret axeln, längs med sömmen. Samla lutning lösningen med mikrocentrifugrör. Som utförs för i botten av röret, hål i röret på ett snabbt och kontrollerat sätt. Träna i förväg och vara mycket noga med att använda en kontrollerad drar rörelse för att förhindra att tvingas nålen från passerar genom röret och in i ett finger! Använd en tidigare kalibrerad pump kurs som kommer att ge 12 x 425 l fraktioner i 12 minuter (425 l min -1).
- Använd en digital refraktometer (t.ex. Reichert AR200, rekommenderas) eller en analysvåg att kontrollera tätheten av fraktioner från en lutning för att bekräfta korrekt gradient bildas. Du kommer att behöva använda ~ 50 ìl av provet för det här testet. Vi inkluderar ofta renkultur DNA i ett rör (som beskrivs för att förbereda EtBr kontroll övertoningar) att fungera som en kontroll för fraktionering och använda detta för densitet beslutsamhet. Räkna med tätheten till mellan ~ 1,690-1,760 g ml -1, med ett medianvärde densitet på ~ 1,725 g ml -1.
7. DNA Nederbörd
- Fällning DNA från alla fraktioner genom att först lägga 20 mikrogram av linjära polyakrylamid som bärare av nederbörd. Blanda genom inversion. Tillsätt 2 volymer av PEG-lösning (se steg 1) och blanda genom inversion. Observera att ett transportföretag för fällning (t.ex. glykogen eller linjär polyakrylamid) är kritisk för kvantitativa återvinning av DNA från gradient fraktionerna, men försiktighet bör användas om glykogen används som bärare för nederbörd för detta protokoll. Glykogen förberedelser har visat sig vara förorenade med bakteriell nukleinsyra och föroreningar kan lätt förvirra tolkningen av SIP-gradient fraktioner 12.
- Lämna rören i rumstemperatur i 2 timmar för att låta DNA fällas ut. Om så önskas kan rören lämnas över natten i rumstemperatur.
- Centrifugera vid 13 tusen g under 30 minuter med baksidan av rören vänd utåt för en konsekvent rör orientering i rotorn. Noggrant Aspirera och kassera supernatanten. En pellets ska vara synliga men kan vara mycket svårt att se på detta stadium. Arbetet inom en stark ljuskälla (t.ex. skrivbordslampa) att hjälpa till att visualisera pelleten.
- Tvätta pelleten med 500 ìl av 70% etanol. Centrifugera vid 13 tusen gi 10 minuter. Noggrant Aspirera och kassera supernatanten. Pelleten kommer vanligtvis att vara mer synliga för detta steg, men kommer att ta avstånd från rörväggen lättare.
- Låt pelleten torka i rumstemperatur i 15 minuter.
- Häng varje pelleten i 50 ìl TE buffert (se steg 1.5). Kör 5 ìl av varje fraktion på en agarosgel enligt standard lab protokoll.
8. Bråk Karaktärisering
Den metod som används för att karaktärisera gradient fraktioner för att bedöma framgången för en SIP inkubationstiden varierar beroende på labbet och tillgänglighet av utrustning. Använda ett fingeravtryck metod för inriktning på 16S rRNA-genen är en gemensam strategi och metoder såsom terminalen begränsning fragment längd polymorfism (T-RFLP) eller denaturering gradient gelelektrofores (DGGE) är lämpliga (figur 1). Efter det protokoll som beskrivs ovan, förväntar ljuset DNA att förknippas med bråk 9-11 (~ 1,705-1,720 g ml -1) och de tunga fingeravtryck DNA att förknippas i fraktioner 5-8 (~ 1,720-1,735 g ml -1 ). Unik fingeravtryck i samband med bråk 5-8 av stabila-isotopen inkuberas proverna, men inte med native-substrat inkuberas kontroller ger starka bevis för sambandet mellan specifika organismer med metabolismen av särskilt märkta substrat. Om otillräckligt märkt DNA återstår för vissa tillämpningar (hybridisering, metagenomik), kan flera förskjutning förstärkning användas till att producera större mängder 13-15 men detta kan införa chimärer till förstärkta DNA 14,16.
Typiska DNA-SIP resultat kommer att visa en separation mellan märkta och omärkta DNA i övertoningen som bildas av ultracentrifugering. Helst ska fullständig tillbakagång av hög molekylvikt genetiska material (t ex 13 C, 15 N) från omärkta material uppnås. Upplösning kan bevittnas visuellt genom att observera band bildas i EtBr kontroll rör. Halterna av hämtade genomiska DNA som finns i de enskilda gradienten fraktioner kan också användas för att bekräfta korrekt gradient bildas.
För detta protokoll, inkluderar vi representativa resultat av lutning ultracentrifugering utförs med hjälp av nukleinsyra från två rena kulturer (Figur 2). Den fraktionerade lutning ingår här var beredd att använda genomisk DNA från S. meliloti (ATCC 1021) och 13 C-märkt M. capsulatus str. Bath. Efter ultracentrifugering, fraktionering och DNA återhämtning, märkta och omärkta genomiska DNA separat i respektive gradient fraktioner med olika densitet (Figur 2A). Heavy-isotop märkt DNA kan observeras i fraktioner 4-5, medan omärkta DNA finns i höga koncentrationer i fraktioner 9-10. DNA från varje fraktion präglades med denaturering lutning gelelektrofores 17 och PCR-amplifierade produkter genererade diskreta ränder mönster som motsvarar de två organismerna som ingår i lutning (Figur 2B). Densiteten av de fraktioner som varierade från ~ 1,580 till 1,759 g ml -1, och de visas i fallande densitet från vänster till höger.
Även om separation av rena 13 C-och 12 C-DNA kan uttalas (Figur 2), får miljö-prov inkubationer vara svårare att tolka. Till exempel, ruvade Vi tundran jordar från Resolute Bay (Nunavut, Kanada) med antingen 12 C-eller 13 C-märkt glukos för en 14-dagars period vid 15 ° C. Den agarosgeler renat lutning bråkdel DNA visat att arvsmassans DNA var "utsmetad" över fraktioner 7-10 för både 12 C-och 13 C-inkubationer (figur 3A och 3C, respektive). I detta fall kan 13 C-anrikning av biomassa från viss mikrobiell taxa endast bestämmas med en metod som DGGE av 16S rRNA gener. Den 12 C-glukos inkuberas jorden DNA genererar liknande mönster i alla lutning fraktioner (Figur 3B), men 13 C-glukos inkuberas provet genereras DGGE fingeravtryck som unikt är förknippade med fraktioner 5-8 (Figur 3D). Av särskilt intresse är de bevarade band som anges av pilarna. Denna dominerande "phylotype" är genomgående i alla lutning fraktioner men övergår till tyngre fraktioner för DNA från 13 C-glukos inkuberas jord. Efter DNA-sekvensering av detta band och / eller klona biblioteket analys skulle bekräfta identiteten hos denna 16S rRNA genen och vägleda efterföljande metagenomic eller odling tillvägagångssätt.
Figur 1. Disposition av en DNA-SIP experiment med prov inkubation, DNA-extraktion, CsCl densitetsgradient ultracentrifugering och DNA karakterisering med molekylära tekniker.
Figur 2. Förväntat resultat för en SIP-gradient fraktionering inklusive DNA från två rena kulturer. (A) Lika delar av DNA från gradient fraktioner 1-12 kördes på en 1% agarosgel från en gradient med 13 C-märkt M. capsulatus stam Bath (fraktioner 4-6) och 12 C-märkt S. meliloti (fraktioner 8-10). En 1-kb stege ingår för jämförelse (B) PCR-amplifierade DNA från samma fraktioner kördes på en 10% DGGE gel. Fingerprint mönster visar tydliga skillnader mellan fraktioner 5 och 9, till exempel.
Figur 3. Förväntade resultat för SIP gradient fractionations från inkubationer jordprov. Lika delar av gradient fraktioner från både 12 ändras C-glukos jord (A) och 13 C-glukos ändras jord (C) kördes på 1% agarosgeler och en 1-kb stege ingår för jämförelse. Motsvarande DGGE fingeravtryck för vart och ett av dessa prover visas i (B) och (D). Fingeravtryck av fraktioner avslöjar anrikning av särskilda bakteriella taxa i de 13 ändrade C-glukos prov i fraktioner 5-8 (D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Korrekt konstruktion av stabila-isotop sondering experiment är av avgörande betydelse för att få märkt DNA över omärkta bakgrunden gemenskapen. Överväganden i samband med prov inkubationstider, koncentrationer substrat, villkor inkubation (t.ex. näring, jord fukthalt), cross-matning och replikering har diskuterats på andra håll 10,18 och vi rekommenderar läsaren samråda med dessa publikationer när man utformar en SIP-inkubation. Relaterad till den aktuella protokollet är det värt att kommentera ytterligare överväganden i samband med tolkning av data från SIP gradienter. På grund av karaktären av ultracentrifugering processen är det dessutom viktigt att inkludera kontroller såsom rena kulturer och infödda-substrat inkuberas prover för att säkerställa att band visas eller försvinner i synnerhet fraktioner inte artefakter i själva protokollet. Till exempel kan DNA i en ultracentrifugen gradient inte bli synlig i en agarosgel (Figur 2A), men kan fortfarande förorena fulla längd gradient (Figur 2B). Även M. capsulatus mönster är tydligast i den täta fraktioner (5-7) i gelen visas i figur 2B, var samma DGGE mönster som följs i de lättaste fraktionen (12). Med genomtänkta kontroller, är tolkning av SIP uppgifter gradient bråkdel möjligt.
På grund av karaktären hos vissa väldesignade SIP-experiment (t.ex. nära in situ substrat koncentrationer, korta inkubationstiderna) kan isotop inbyggnad vara mycket låg 10. Dessutom har de flesta mikroorganismer i mark-eller vattenmiljöer har lång generation gånger jämfört med tillväxten i laboratoriet, och kräver förlängd inkubering gånger för att nå mätbara halter av isotopisk anrikning. Andra populationer kan vara i stånd att metaboliserar en mängd olika substrat, och kan inte växa helt och hållet om märkta substrat. Det finns också samhällen (t ex grundvatten) som kan vara förknippade med låga biomassan och genererar låg avkastning av utvunnet nukleinsyra. I alla dessa fall kan kvantitativa hämtning av märkta nukleinsyror vara utmanande.
För att kringgå dessa begränsningar, en mängd av naturliga och syntetiska bärarmolekyler finns att hjälpa till med nederbörd och återvinning av DNA från CsCl gradienter. Bärarmolekyler kan vara biologiskt ursprung som glykogen eller DNA från en archaeal organism 19, eller syntetiska i naturen, som linjär polyakrylamid. Fördelen med att använda bärarmolekyler som dessa när de utför DNA-SIP är att de kan göra det möjligt för visualisering av banden i CsCl gradienter som normalt inte skulle synas och se kvantitativa återvinning av låga DNA-koncentrationer. Lyckad återvinning av låga nanogram mängder DNA från CsCl lutningar kräver faktiskt att använda en transportör molekyl 1,12. Ny forskning har visat att bärarmolekyler från biologiska källor ofta kan vara förorenade med DNA från källan Organism 12 och resultaten är mycket svåra att skilja från mönster i samband med 13 C-märkt DNA (data visas inte). Därför rekommenderas att syntetiska bärarmolekyler som linjär polyakrylamid användas för DNA-SIP. Dessutom kan användningen av flera deplacement förstärkning (MDA) generera hifi avkastningen av märkta DNA för nedströms molekylära analyser 13,14, även chimärer kan genereras av förstärkning och återfanns i nedströms molekylära analyser 14.
En av de mest kraftfulla program av DNA-SIP som ännu utnyttjas fullt ut är den potentiella återhämtningen av DNA från aktiva community medlemmar för metagenomic biblioteket analys. Vi räknar med att stora framsteg i enzymet upptäckten kommer att leda till integration av stabila isotopen-sondering i befintliga metagenomic undersökningar från olika terrestra och akvatiska miljöer. Protokollet visualiseras här kommer att producera märkt DNA av tillräcklig kvalitet för dessa upptäckter-baserade program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Strategic Project och bidrag Discovery till JDN från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bromophenol Blue | Reagent | Fisher Scientific | BP115-25 | |
| Cesium chloride | Reagent | Fisher Scientific | BP210-500 | |
| Ethanol, reagent grade | Reagent | Sigma-Aldrich | 652261 | |
| Ethidium bromide | Reagent | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Hydrochloric acid | Reagent | Fisher Scientific | 351285212 | |
| Linear polyacrylamide | Reagent | Applichem | A6587 | |
| Polyethylene Glycol 6000 | Reagent | VWR international | CAPX1286L-4 | |
| Potassium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | AC42409-0010 | |
| Sodium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | S2711 | |
| Sodium Hydroxide pellets | Reagent | Fisher Scientific | S3181 | |
| Tris base | Reagent | Fisher Scientific | BP1521 | |
| Dark Reader | Equipment | Clare Chemical | DR46B | |
| Microcentrifuge | Equipment | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| Nanodrop 2000 | Equipment | Fisher Scientific | 361013650 | |
| Infusion pump | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | N/A | Model Number: BSP See www.braintreesci.com for ordering details. |
| Tube sealer | Equipment | Beckman Coulter Inc. | 358312 | |
| Ultracentrifuge | Equipment | Beckman Coulter Inc. | ||
| Ultracentrifuge rotor | Equipment | Beckman Coulter Inc. | 362754 | |
| Ultraviolet light source | Equipment | UVP Inc. | 95-0017-09 | Any UV source will suffice |
| Ultraviolet light face shield | Equipment | Fisher Scientific | 114051C | |
| Butyl rubber stoppers, gray | Material | Sigma-Aldrich | 27232 | |
| Centrifuge tubes | Material | Beckman Coulter Inc. | 342412 | |
| Hypodermic needle, 23 gauge, 2” length | Material | BD Biosciences | 305145 | |
| Microfuge tubes, 1.5 mL | Material | DiaMed | AD151-N500 | |
| Open center seals, 20 mm diameter | Material | Sigma-Aldrich | 27230-U | |
| Pasteur pipettes, glass | Material | Fisher Scientific | 13-678-6C | |
| Pipet tips | Material | DiaMed | BPS340-1000 | Catalogue number is for 200 μl tips. 10 or 20 μl tips may be purchased from the same source |
| Pump tubing 1.5 mm bore x 1.5 mm wall | Material | Appleton Woods | ||
| Screw-cap tubes, 15 mL | Material | DiaMed | AD15MLP-S | |
| Serum vials, 125 mL volume | Material | Sigma-Aldrich | Z114014 | |
| Syringe, 60 mL | Material | BD Biosciences | 309653 |
References
- Neufeld, J. D. DNA stable-isotope probing. Nat. Protocols. 2, 860-866 (2007).
- Neufeld, J. D., Boden, R., Moussard, H., Schäfer, H., Murrell, J. C. Substrate-specific clades of active marine methylotrophs associated with a phytoplankton bloom in a temperate coastal environment. Appl. Environ. Microbiol. 74, 7321-7328 (2009).
- Nercessian, O., Noyes, E., Kalyuzhnaya, M. G., Lidstrom, M. E., Chistoserdova, L. Bacterial populations active in metabolism of C1 compounds in the sediment of Lake Washington, a freshwater lake. Appl. Environ. Microbiol. 71, 6885-6899 (2005).
- Padmanabhan, P. Respiration of 13C-labelled substrates added to soil in the field and subsequent 16S rRNA gene analysis of 13C-labelled soil DNA. Appl. Environ. Microbiol. 69, 1614-1622 (2003).
- Bernard, L. Dynamics and identification of soil microbial populations actively assimilating carbon from 13C-labelled wheat residue as estimated by DNA- and RNA-SIP techniques. Environ. Microbiol. 9, 752-764 (2007).
- Haichar, elZ. ahar, F, Identification of cellulolytic bacteria in soil by stable isotope probing. Environ. Microbiol. 9, 625-634 (2007).
- Addison, S., McDonald, I., Lloyd-Jones, G. Stable isotope probing: Technical considerations when resolving 15N-labelled RNA in gradients. J. Microbiol. Meth. 80, 70-75 (2009).
- Buckley, D. H., Huangyutitham, V., Hsu, S. -F., Nelson, T. A. Stable isotope probing with 15N achieved by disentangling the effects of genome G + C content and isotope enrichment on DNA density. Appl. Environ. Microbiol. 73, 3189-3195 (2007).
- Schwartz, E. Characterization of growing microorganisms in soil by stable isotope probing with H218O. Appl. Environ. Microbiol. 73, 2541-2546 (2007).
- Neufeld, J. D., Dumont, M. G., Vohra, J., Murrell, J. C. Methodological considerations for the use of stable isotope probing in microbial ecology. Microb. Ecol. 53, 435-442 (2007).
- Martineau, C., Whyte, L., Greer, C. Development of a SYBR safe technique for the sensitive detection of DNA in cesium chloride density gradients for stable isotope probing assays. J. Microbiol. Meth. 73, 199-202 (2008).
- Bartram, A. K., Poon, C., Neufeld, J. D. Nucleic acid contamination of glycogen used in nucleic acid precipitation and assessment of linear polyacrylamide as an alternative co-precipitant. Biotechniques. 47, 1019-1022 (2009).
- Chen, Y. Revealing the uncultivated majority: combining DNA stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomic analyses of uncultivated Methylocystis in acidic peatlands. Environ. Microbiol. 10, 2609-2622 (2008).
- Neufeld, J. D., Chen, Y., Dumont, M. G., Murrell, J. C. Marine methylotrophs revealed by stable-isotope probing, multiple displacement amplification and metagenomics. Environ. Microbiol. 10, 1526-1535 (2008).
- Kalyuzhnaya, M. High-resolution metagenomics targets specific functional types in complex microbial communities. Nat. Biotechnol. 26, 1029-1034 (2008).
- Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2, 233-241 (2008).
- Green, S. J., Leigh, M. B., Neufeld, J. D. Microbiology of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. Timmis, K. N. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 4137-4158 (2010).
- Neufeld, J. D., Wagner, M., Murrell, J. C. Who eats what, where and when? Isotope-labelling experiments are coming of age. ISME J. 1, 103-110 (2007).
- Gallagher, E., McGuinness, L., Phelps, C., Young, L. Y., Kerkhof, L. J. DNA shortens the incubation time needed to detect benzoate-utilizing denitrifying bacteria by stable-isotope probing. Appl. Environ. Microbiol. 71, 5192-5196 Forthcoming.
