Summary
빠른 방법은 세포외 기질에서 다당류의 구조에 대한 통찰력을 얻을 수 설명되어 있습니다. 방법은 glycosylhydrolases의 특이성과 물질의 미세한을 분석 수 있도록 질량 분석계의 감도 활용합니다. 이 기술은 조직 자체에서 직접 사용할 수 적용할 수 있습니다.
Abstract
환경에 세포의 직접 접촉은 세포외 기질로 많은 생물의 중재입니다. 세포외 매트릭스 중 하나는 일반적인 측면들은 복잡한 설탕 glycoproteins 형태의 moieties, proteoglycans, 및 / 또는 다당류를 포함한다는 것입니다. 예 원섬유의 단백질과 proteoglycans 또는 식물과 곰팡이의 다당류 기반의 세포 벽 주로 구성된 인간과 동물 세포의 세포외 기질과 proteoglycan / 박테리아의 glycolipid 기반의 세포 벽을 포함합니다. 이러한 모든 glycostructures는 휴대 전화 및 휴대 환경 통신 및 신호에서 중요한 역할을 재생합니다.
세포외 기질의 특별한 복잡한 예제는 높은 식물 세포의 벽에 속해 있습니다. 그들의 벽이 최대 75% 건조 중량, 당분의 거의 전적으로 만들어진,이 지구상에서 존재하는 가장 풍부한 biopolymers 구성되어 있습니다. 따라서, 연구는 화석 연료에서 파생 석유를 대체할 수있는 탄소 중립 재생 자원으로 최고 이러한 자료를 활용하는 방법을 실시합니다. 연료 전환의 주요 과제는이 독특한 biocomposite에있는 독특한 glycostructures에 의한 효소 또는 화학적 열화에 벽의 말을 안들음 남아 있습니다.
여기, 우리는 식물 세포 벽의 glycostructures의 신속하고 민감한 분석을위한 방법을 제시한다. 이 방법은 OLIgo 질량 프로파일 (OLIMP)은 (MALDI-TOF/MS 매트릭스를 이용한 레이저 탈착 / 이온화 시간의 기내 질량 분석법을 사용하여 특정 glycosylhydrolases 및 solubilized 올리 고당 혼합물의 후속 분석을 촉진 벽 자료에서 oligosaccharides의 효소 릴리스를 기반으로합니다 1) (그림 1). OLIMP은 전체 분석에 대해서만 5,000 세포의 벽이, 조직 자체 2 수행할 수 있어야하고, 높은 처리량 분석 3 의무가 있습니다. solubilized oligosaccharides의 절대 금액이 OLIMP에 의해 결정되지 않을 수 있지만 각종 올리 고당 이온의 상대적인 풍부가 벽에 현재 기본 다당류의 대체 패턴에 대한 통찰력을주는 질량 스펙트럼에서 delineated 수 있습니다.
OLIMP은 특정 효소 4의 가용성에 의해 제한 벽 폴리머의 다양한 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 식물 세포 벽의 효소에있는 폴리머의 분석을 위해 엔도 - β - (1-4) - xylanase 6,7을 사용하여 xyloglucanase 5, 11, 12, 13, 크실란를 사용하여 hemicelluloses의 xyloglucan을 분석하실 수 있습니다 또는 polygalacturonase와 methylesterase 8 조합을 사용하여 pectic 다당류하십시오. 또한, OLIMP glycosylhydrolase 심지어 glycosyltransferase 활동의 동일한 원리를 사용하는 것은 감시하고 9 결정하실 수 있습니다.
Protocol
OLIMP 방법은 glycosylhydrolase으로 endoglucanase를 사용하여 dicot 식물, xyloglucan의 세포 벽에있는 주요 hemicellulose에 exemplified입니다. 방법은 식물 조직 소스로 전체 Arabidopsis 모종로 증명됩니다. 효소와 세포외 매트릭스 물질은 동일한 절차를 사용하여 원하는 분석에 따라 대체하실 수 있습니다.
1. 세포 벽 절연
- 하베스트 오 5 일 이전 전체 Arabidopsis 모종이나 원하는 자료의 상당 금액 및 1.5mL 반응 관에 그들을 전송합니다. 자료가 튜브의 아래쪽에 배치되었는지 확인합니다.
- 액체 질소의 샘플 및 스냅인 동결 위에 반응 관에 두 3mm 금속 공을 추가합니다.
- 볼 - 밀 (2시 반 분, 25Hz)를 사용하여 냉동 샘플을 분쇄.
- 샘플에 1mL 70% 수성 에탄올을 추가합니다. 자석을 사용하여 금속 공을 제거합니다. 철저히 와동.
- 펠렛에 10 분 세포 벽 재료가 들어있는 알코올 불용성 잔류물을 위해 14,000 RPM에서 샘플을 원심 분리기.
- 조심스럽게 흡인하여 뜨는을 제거하십시오. 펠렛을 방해하지 않도록하십시오.
- 클로로포름 / 메탄올 (1:1 V / V) 솔루션의 1mL를 추가합니다. 펠렛을 resuspend에 철저 와동.
- 10 분 14,000 RPM에서 샘플을 원심 분리기 조심스럽게 흡인하여 뜨는을 제거하십시오. 펠렛을 방해하지 않도록하십시오.
- 농축기를 사용하여 샘플을 건조시킵니다.
2. oligosaccharides의 Solubilization
- solubilization에 대한 oligosaccharides의 형태로 특정 다당류는 적절한 버퍼 25μl의 건조 펠렛을 resuspend. endoglucanase 50mM 질산 편대, pH4.5을 위해 사용됩니다. endoglucanase의 0.2U를 추가합니다. 아래 소용돌이 서스펜션과 스핀 액체.
- 37 16h에 대한 샘플을 품어 ° C를 인큐베이터에서 300rpm에서 떨고.
- 농축기를 사용하여 소화 (물)의 용매를 제거합니다.
3. 출시 oligosaccharides의 든 - TOF 분석
- BioRex MSZ 501의 양이온 교환 수지 비즈는 소화 샘플에서 소금과 효소를 제거하는 데 사용됩니다. 빈 열에 나누어지는을 배치하고 물을 풍부한 양의으로 구슬을 씻는하여 조건 비즈 있습니다.
- 소화와 말린 예제 5-10 BioRex 비즈를 추가합니다. 그런 다음 물 재료 5μl 작은 양의 사용할 수 있습니다위한 물 10μl를 추가합니다. 간단히 튜브를 회전하여 솔루션 비즈 젖어. 상온에서 적어도 10 분에 대해 품어.
- 든 대상 플레이트에 자리 2μl 매트릭스 (2,5 - dihydroxybenzoic 산성 (DHB), 물에 10mg/ml). 동질 매트릭스 화학 크리스탈로 이어지는 진공 하에서 용매 매트릭스를 증발.
- 대상 접시 매트릭스 결정 위에 desalted 샘플 솔루션의 스팟 2μl.
이 샘플의 많은 지점하려는 경우에만 3min의 최대 야생 계속. 이 시간 프레임은 최초의 발견 샘플 아직 건조되지 않도록합니다. 마지막으로 발견 샘플에서 다시 용해 매트릭스와 샘플 올리 고당 분자의 철저한 혼합을 보장하기 위해 추가 2min 나올 때까지 기다리는 것이 좋습니다. 다음 진공에서 대상 번호판을 건조.
샘플 / 매트릭스 믹스는 동질적인 결정을 활성화 1min 이하에서 구체화한다. - 든 - TOF 질량 분석기로 대상 플레이트 플레이스. 기계 20000V의 가속 전압과 350 nm의의 지연 긍정 reflectron 모드로 설정되어야하며 선택된 질량 범위 (수가 예상 oligomers에 따라 변경) 500-3000 다해야합니다. 레이저를 쏘면서 시작하고 대표적인 평균 스펙트럼 (그림 2A)를 생성하는 컴파일 샘플 당 100-200 스펙트럼을 수집합니다. 특정 oligosaccharides를 나타내는 이온은 요금 (M / Z) 비율을 통해 그들의 질량에 의해 확인할 수 있습니다. 관심의 이온의 이온 농도 (최대 높이)는 샘플의 각 올리 고당의 상대적인 풍부 (그림 2B)로 인해 100 %까지 추가되어야합니다.
4. 원위치 OLIMP 분석
OLIMP는 모든 벽 준비 단계를 생략 조직에 직접 사용될 수 있습니다. 식물 조직 소스가 사용하는 같은 예제는 Arabidopsis의 hypocotyls을 etiolated으로. 다시 endoglucanase는 hemicelluloses의 xyloglucan의 구조를 결정하는 데 사용됩니다. 효소 및 조직 재료는 동일한 절차를 사용하여 원하는 분석에 따라 대체하실 수 있습니다.
- etiolated 묘목을 수확하고 비어 든 대상 플레이트에 그것을 장소와 묘목이 건조하게.
- 원하는 위치에 말린 세들링에 0.5μl endoglucanase을 (50mM 질산 편대에 녹아있는 0.4U/μl, pH4.5)을 추가합니다. 효소 드롭 타겟 플레이트 부분적으로 접촉되었는지 확인합니다.
- 피하기 위해 포화 습도와 닫힌 용기에 든 대상 플레이트를 삽입하는 효소 드롭 마른 아웃. 1 챔버에서 번호판을 품어37 6h가 ° C.
- 식물 조직과 진공에서 효소 드롭으로 든 대상 플레이트를 건조시킵니다.
- 각 건조 효소 자리 위에, 0.5μl 매트릭스 (10mg / L DHB) 추가합니다. 그것이 2min에 대한있게 해줘요.
- 진공에서 든 대상 플레이트를 건조시킵니다.
- 든 - TOF와 샘플을 분석할 수 있습니다. 든 - TOF 질량 분석기로 조직과 효소 / 매트릭스 지점 (S)와 타겟 플레이트 플레이스. 기계 20000V의 가속 전압과 350 nm의의 지연 긍정 reflectron 모드로 설정되어야하며 선택된 질량 범위 (수가 예상 oligomers에 따라 변경) 500-3000 다해야합니다.
- 조직 옆에 매트릭스 / 샘플 결정에 레이저를 발사 시작합니다. 이 같은 분자의 비행 -의 시간이 끝날거야 이런 경우에, 조직 자체에 충돌하지 않도록합니다. 대표 평균 스펙트럼 (그림 3)을 생성하는 컴파일 장소, 당 20-50 주위 스펙트럼를 수집합니다. 특정 oligosaccharides를 나타내는 이온은 요금 (M / Z) 비율을 통해 그들의 질량에 의해 확인할 수 있습니다. 이온 농도 (이온 높이)를보고 수 있으며, 관심있는 모든 이온이 예제에서 각 oligosaccharides의 상대적인 풍부 결과 100 %까지 추가되어야합니다.
5. 대표 결과
Arabidopsis 모종에있는 hemicelluloses의 xyloglucan의 OLIMP 분석의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 이온의 질량 차이 및 알려진 잘 특징 효소로 인해 (endoglucanase) 특이성은 이온은 특정 올리 고당 구조 (그림 2A)에 할당할 수 있습니다. 분명히, 구조 isomers는 구별되지 않습니다. 다양한 oligosaccharides의 상대적인 풍요의 결정에 대한 기본 가정은 (그림 2B)은 질량 분석기를 응답 계수 이러한 oligosaccharides 매우 비슷하다고합니다. 여기에 그림과 같이, OLIMP 부량는 매우 재현할 수 있습니다. 그러나, 방법의 견고는 각종 올리 고당 이온의 잡음 비율로 신호에 크게 의존된다는 점에 유의하시기 바랍니다. 예를 들면 소금이나 oligosaccharides의 낮은 금액과 오염은 비율을 줄일 수 있습니다.
조직 자체 (현장 분석)에 OLIMP 분석은 매우 작고 정의된 영역의 연구를 가능하게하고 아주 작은 샘플 준비 포함됩니다. 예제에 정성 (동일 이온)는 (그림 3) 여기에 제시 아니지만 양적 차이는 (이온 농도의 변화) Arabidopsis 묘목의 촬영 및 루트 - 조직 사이에 관찰되었다. OLIMP - 방법 Permutations 따라서 조직 "이미지"가 발생할 수 있습니다.
그림 1. 플랜트 원본으로 전체 Arabidopsis의 모종을 사용하여 OLIMP 절차의 플로우 차트. 첫째, 조직이 분해되고 세포 벽 재료 (사진 후지노 외에서 수정되었습니다. 10) 준비가되어 있습니다. 그런 다음 특정 벽면 다당류의 oligosaccharides은 특정 하이드롤라제를 사용하여 발표하고 있습니다. 마지막으로, 가용성 oligosaccharides의 상대 abundances이 든 - TOF 질량 분광법을 사용하여 결정됩니다.
그림 2. OLIMP에 의해 결정으로 Arabidopsis에서 etiolated 모종의 xyloglucan의 oligosaccharides의 상대 풍부. A) 대표 xyloglucan 올리 고당 질량 스펙트럼, 각 이온이 특정 올리 고당 구조를 나타내고, 구조 isomers는 구별되지 않습니다. 상대 올리 고당 풍요의 결정에 대해 B) 해당 막대 다이어그램.
그림 3. 예로 Arabidopsis의 etiolated 모종을 사용하여 현장 OLIMP 분석. 각 효소 / 소화 소적 (유색 원)는 독립적으로 분석할 수 있으며 해당 질량 스펙트럼을 얻을하고 분석할 수 있습니다.
그림 4. xylanase (Megazyme)와 Miscanthus 리프 자료를 소화하여 얻은 hemicellulose의 크실란의 OLIMP 스펙트럼.
Discussion
여기에 제시 OLIMP 메서드는 세포외 매트릭스에 존재 폴리머 매우 민감하고 신속한 분석이 가능합니다. OLIMP는 이후 든 - TOF 분석 oligomers의 효소 릴리스를 결합한 제품입니다. 든 - TOF 스펙트럼의 세대 미만 분 소요, 따라서 OLIMP는 돌연변이 스크린으로 높은 처리량 연구를 포함한 어플 리케이션의 광범위한 적합합니다. OLIMP는 식물의 다당류에 제한된 것은 아니지만 잠재적으로 특정 가수 분해 효소의 가용성에 의해 제한 고분자의 다양한 적용할 수 있습니다. 그러나, OLIMP의 제한은 폴리머의 절대 풍부를 얻을 수 없다는 것입니다.
OLIMP가 종 다양성의 세포외 기질에 존재 다당류의 다양한 구조를 연구하는 데 사용할 수있는 이전처럼 언급했다. 예를 들어, 그림 4는 잔디 종의 주요 hemicellulose, 크실란의 OLIMP 스펙트럼을 나타냅니다. 여기, 온대 잔디 Miscanthus에서 파생된 세포 벽 재료는 xylanase를 사용하여 소화했다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 에너지 Biosciences 연구소 부여 OO0G01에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL in water |
| BioRex MSZ 501(D) Resin | Bio-Rad | 142-7425 | |
| Endoglucanase | Megazyme | E-CELTR | |
| Xylanase M6 | Megazyme | E-XYRU6 | |
| 3mm metal balls | Retsch | 22.455.0011 | |
| Beat mill | Retsch | Mixer Mill MM400 | |
| MALDI-TOF | Shimadzu Corporation | Axima Performance | |
| MALDI target plate | Kratos Analytical | DE4555TA | |
| SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | |
| Vacuum manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | |
| Vacuum pump | Welch Allyn | DryFast Ultra 2032 |
References
- Lerouxel, O. Rapid structural phenotyping of plant cell wall mutants by enzymatic oligosaccharide fingerprinting. Plant Physiology. 130 (4), 1754-1754 (2002).
- Obel, N. Microanalysis of plant cell wall polysaccharides. Molecular Plant. 2 (5), 922-922 (2009).
- Mouille, G. Quantitative trait loci analysis of primary cell wall composition in Arabidopsis. Plant Physiology. 141 (3), 1035-1035 (2006).
- Bauer, S. Development and application of a suite of polysaccharide-degrading enzymes for analyzing plant cell walls. PNAS. 103 (30), 11417-11417 (2006).
- Pauly, M. A xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus: expression cloning in yeast, purification and characterization of the recombinant enzyme. Glycobiology. 9 (1), 93-93 (1999).
- Aboughe-Angone, S. Cell wall carbohydrates from fruit pulp of Argania spinosa: structural analysis of pectin and xyloglucan polysaccharides. Carbohydr Res. 343 (1), 67-67 (2008).
- Brown, D. M. Comparison of five xylan synthesis mutants reveals new insight into the mechanisms of xylan synthesis. Plant Journal. 52 (6), 1154-1154 (2007).
- Lee, C. The PARVUS gene is expressed in cells undergoing secondary wall thickening and is essential for glucuronoxylan biosynthesis. Plant Cell Physiol. 48 (12), 1659-1659 (2007).
- Obel, N. Pectin may hinder the unfolding of xyloglucan chains during cell deformation: implications of the mechanical performance of Arabidopsis hypocotyls with pectin alterations. Molecular Plant . , (2009).
- Cavalier, D. M., Keegstra, K. Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).
- Leonard, R. Identification of an Arabidopsis gene encoding a GH95 alpha1,2-fucosidase active on xyloglucan oligo- and polysaccharides. Phytochemistry. 69 (10), 1983-1983 (2008).
- Cavalier, D. M., Keegstra, K. Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).
- Lee, C. H. The irregular xylem9 mutant is deficient in xylan xylosyltransferase activity. Plant and Cell Physiology. 48 (11), 1624-1624 (2007).
- Iglesias, N. Apoplastic glycosidases active against xyloglucan oligosaccharides of Arabidopsis thaliana. Plant and Cell Physiology. 47 (1), 55-55 (2006).
- Fujino, T., Sone, Y., Mitsuishi, Y., Itoh, T. Characterization of cross-links between cellulose microfibrils, and their occurrence during elongation growth in pea epicotyl. Plant Cell Physiol. 41 (4), 486-486 (2000).
- Vanzin, G. F. The mur2 mutant of Arabidopsis thaliana lacks fucosylated xyloglucan because of a lesion in fucosyltransferase AtFUT1. PNAS. 99 (5), 3340-3340 (2002).
- Cavalier, D. M. Disrupting two Arabidopsis thaliana xylosyltransferase genes results in plants deficient in xyloglucan, a major primary cell wall component. Plant Cell. 20 (6), 1519-1519 (2008).
- Hilz, H. A comparison of liquid chromatography, capillary electrophoresis, and mass spectrometry methods to determine xyloglucan structures in black currants. Journal of Chromatography A. 1133 (1-2), 275-275 (2006).
- Pauly, M. Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells. Planta. 214 (1), 67-67 (2001).
