Summary
Uma maneira rápida é descrito para obter insights sobre a estrutura de polissacarídeos em uma matriz extracelular. O método aproveita a especificidade do glycosylhydrolases ea sensibilidade da espectrometria de massa permitindo que pequenas quantidades de materiais a serem analisados. Esta técnica é adaptável para ser usada diretamente sobre o tecido em si.
Abstract
O contato direto das células para o meio ambiente é mediada, em muitos organismos por uma matriz extracelular. Um aspecto comum de matrizes extracelulares é que eles contêm metades açúcar complexo em forma de glicoproteínas, proteoglicanos e / ou polissacarídeos. Exemplos incluem a matriz extracelular dos seres humanos e células animais que consiste principalmente de proteínas fibrilares e proteoglicanos ou o polissacarídeo paredes à base de células de plantas e fungos, e os proteoglicanos / glicolipídeo paredes à base de células de bactérias. Todos estes glycostructures desempenham um papel vital na célula-célula de comunicação e de células-to-ambiente e de sinalização.
Um exemplo extraordinário complexo de uma matriz extracelular está presente nas paredes das células de plantas superiores. Sua parede é feito quase inteiramente de açúcares, até 75% do peso seco, e consiste dos biopolímeros mais abundantes presentes no planeta. Portanto, a pesquisa é conduzida como utilizar esses materiais melhores como um recurso de carbono neutro renováveis para substituir derivados petroquímicos de combustíveis fósseis. O principal desafio para a conversão de combustível permanece a recalcitrância de paredes à degradação enzimática ou química, devido à glycostructures única presente neste biocomposite único.
Aqui, apresentamos um método para a análise rápida e sensível da planta glycostructures parede celular. Este método Profiling Massa Oligo (OLIMP) baseia a liberação enzimática de oligossacarídeos a partir de materiais de parede facilitar glycosylhydrolases específica e posterior análise das misturas de oligossacarídeos solubilizada usando matrix-assisted laser de dessorção / ionização de tempo de vôo espectrometria de massa (MALDI-TOF/MS ) 1 (Figura 1). OLIMP exige paredes de apenas 5.000 células para uma análise completa, pode ser realizada no próprio tecido 2, e é passível de high-throughput análises 3. Embora a quantidade absoluta do oligossacarídeos solubilizados não pode ser determinado por OLIMP a abundância relativa dos íons vários oligossacarídeos pode ser delineada a partir dos espectros de massa dando insights sobre a substituição de padrões do polissacarídeo nativo presente na parede.
OLIMP pode ser usado para analisar uma grande variedade de polímeros de parede, limitada apenas pela disponibilidade de enzimas específicas 4. Por exemplo, para a análise de polímeros presentes na planta enzimas da parede celular estão disponíveis para analisar o xiloglucano hemiceluloses usando um xyloglucanase 5, 11, 12, 13, xilana usando uma endo-β 6,7 (1-4)-xilanase , ou para polissacarídeos pécticos utilizando uma combinação de uma poligalacturonase e um methylesterase 8. Além disso, usando os mesmos princípios de OLIMP glycosylhydrolase e até mesmo atividades glicosiltransferase podem ser monitorados e determinados 9.
Protocol
O método é exemplificado OLIMP na hemicelulose principais presentes nas paredes celulares das plantas dicotiledôneas, xiloglucano, usando uma endoglucanase como o glycosylhydrolase. O método é demonstrado com toda mudas Arabidopsis como fonte de tecidos de plantas. Material de matriz extracelular de enzimas e pode ser substituído em função da análise desejada usando o mesmo procedimento.
1. Isolamento da parede celular
- Colheita cinco 5 dias de idade, todo mudas Arabidopsis ou a quantidade equivalente de seu material desejado e transferi-los em um tubo de reação 1,5 ml. Certifique-se que o material é colocado no fundo do tubo.
- Adicione duas bolas de metal 3 milímetros ao tubo de reação em cima da amostra e encaixe-congelamento em nitrogênio líquido.
- Moer a amostra congelada usando um moinho de bolas (2:30 min, 25Hz).
- Adicione 1 ml de etanol 70% aquoso para a amostra. Retire as bolas de metal usando um ímã. Vortex completamente.
- Centrífuga de amostra a 14.000 rpm por 10 min para sedimentar o resíduo de álcool insolúvel contendo o material da parede celular.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento.
- Adicione 1 ml de clorofórmio / metanol (1:1 v / v). Vortex cuidadosamente para ressuspender o sedimento.
- Centrífuga de amostra a 14.000 rpm por 10 minutos e retire com cuidado o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento.
- Secar a amostra usando um concentrador.
2. Solubilização de oligossacarídeos
- Para a solubilização do polissacarídeo particular sob a forma de sua oligossacarídeos ressuspender o sedimento seco em 25μl de um tampão apropriado. Para o formiato de amônio 50 mM endoglucanase, pH4.5, é usado. Adicionar 0.2U da endoglucanase. Suspensão do Vortex e líquido de spin para baixo.
- Incubar a amostra para 16h a 37 ° C em uma incubadora, agitando a 300rpm.
- Remover o solvente da digestão (água), utilizando um concentrador.
3. MALDI-TOF análise dos oligossacarídeos liberados
- BioRex MSZ cação 501 contas resina de troca são usados para remover sais e enzimas a partir da amostra digerida. Condição de as contas, colocando uma alíquota em uma coluna vazia e lavar as contas com grandes quantidades de água.
- Adicionar contas de 10/05 BioRex para a amostra digerida e secas. Em seguida, adicione água 10μl, para pequenas quantidades de material de 5μl de água pode ser usada. Mergulhe as contas na solução por breves instantes, girando o tubo. Incubar por pelo menos 10 minutos em temperatura ambiente.
- Local 2μl matriz (2,5-dihydroxybenzoic ácido (DHB), 10mg/ml em água) sobre uma placa de MALDI-alvo. Evaporar o solvente sob vácuo matriz levando a cristais químicos homogêneo matriz.
- 2μl local da solução da amostra dessalinizada em cima dos cristais da matriz na placa-alvo.
Se você quiser detectar um grande número de amostras apenas manter a mancha para um máximo de 3min. Este prazo garanta que a amostra spotted primeiro ainda não secou. Esperar por uma 2min adicionais para assegurar uma mistura completa de re-dissolvido matriz e moléculas da amostra de oligossacarídeos na amostra manchado passado. Em seguida, secar a placa-alvo sob um vácuo.
A mistura amostra / matriz deve se cristalizar em menos de 1min para habilitar cristalização homogênea. - Coloque placa de alvo em um espectrômetro de massa MALDI-TOF. A máquina deve ser definida para o modo reflectron positiva com uma tensão de aceleração de 20000V e um atraso de 350 nm, a faixa de massa devem ser selecionados 500-3000 Da (pode mudar depende da oligômeros esperado). Começar a disparar o laser e recolher 100-200 espectros por exemplo, que são compilados para gerar um espectro médio representativo (Figura 2A). Íons representando oligossacarídeos específicos podem ser identificados pela sua massa mais razão de carga (m / z). As intensidades de íons (altura do pico) de todos os íons de interesse devem ser adicionados até 100%, resultando na abundância relativa de cada oligossacarídeo na amostra (Figura 2B).
4. Na análise OLIMP situ
OLIMP também pode ser usado diretamente sobre o tecido omitindo qualquer etapas de preparação da parede. Como um exemplo de hipocótilos estiolados Arabidopsis como fonte de tecidos de plantas são usados. Mais uma vez, uma endoglucanase é usado para determinar a estrutura do xiloglucano hemiceluloses. Enzima e material de tecido pode ser substituído em função da análise desejada usando o mesmo procedimento.
- Colheita um mudas estioladas e coloque-a um prato vazio MALDI-alvo e deixe a seca das plântulas.
- Adicionar 0.5μl endoglucanase (0.4U/μl, dissolvido em formiato de amônio 50 mM, pH4.5) na mudas secas na posição desejada. Certifique-se que a gota toca enzima parcialmente a placa de alvo.
- Coloque a placa de MALDI-alvo em um recipiente fechado com umidade de saturação, para evitar que a queda da enzima seca. Incubar a placa na câmara para um6h a 37 ° C.
- Secar a placa MALDI-alvo com o tecido vegetal ea queda das enzimas sob vácuo.
- Adicionar 0.5μl matriz (DHB; 10mg / l) em cima de cada ponto da enzima secas. Deixe descansar por 2 minutos.
- Secar a placa-alvo MALDI sob vácuo.
- Analisar amostras com o MALDI-TOF. Coloque a placa com o tecido-alvo eo local da enzima / matriz (s) em um espectrômetro de massa MALDI-TOF. A máquina deve ser definida para o modo reflectron positiva com uma tensão de aceleração de 20000V e um atraso de 350 nm, a faixa de massa devem ser selecionados 500-3000 Da (pode mudar depende da oligômeros esperado).
- Começar a disparar o laser para os cristais da matriz / amostra NEXT para o tecido. Certifique-se de não acertar o tecido em si, como no caso, o tempo de vôo das moléculas será desligado. Coletar cerca de 20-50 espectros por spot, que são compilados para gerar um espectro médio representativo (Figura 3). Íons representando oligossacarídeos específicos podem ser identificados pela sua massa mais razão de carga (m / z). As intensidades de íons (ion altura) pode ser relatado e todos os íons de interesse devem ser adicionados até 100%, resultando na abundância relativa de cada oligossacarídeos na amostra.
5. Resultados representante
Um exemplo de uma análise OLIMP da xiloglucano hemiceluloses presentes em mudas de Arabidopsis é mostrado na Figura 2. Devido às diferenças de massa dos íons e da enzima conhecida bem caracterizado especificidade (endoglucanase) os íons podem ser atribuídos a estruturas específicas de oligossacarídeos (Figura 2A). Obviamente, isômeros estruturais não podem ser distinguidos. O pressuposto básico para a determinação da abundância relativa dos vários oligossacarídeos (Figura 2B) é que sua massa factor de resposta de especificações é muito semelhante para os oligossacarídeos. Como mostrado aqui, a quantificação OLIMP é altamente reprodutível. No entanto, observe que a robustez do método é altamente dependente do sinal para relações de ruído dos vários íons oligossacarídeo. Por exemplo a contaminação com sais ou menor quantidade de oligossacarídeos pode diminuir essa relação.
A análise OLIMP sobre o tecido em si (na análise de situ) permite o estudo de áreas muito pequenas e definido e envolve a preparação da amostra muito pouco. No exemplo aqui apresentado (Figura 3) não qualitativa (íons mesma), mas diferenças quantitativas (variação nas intensidades ion) foram observadas entre parte aérea e raiz-tecido da plântula Arabidopsis. Permutações da OLIMP método, poderia, assim, levar a "imagem" do tecido.
Figura 1. Fluxograma do procedimento OLIMP utilizando mudas Arabidopsis inteiro como uma fonte de planta. Primeiro, o tecido é macerado e material da parede celular está preparado (foto modificada de Fujino et al. 10). Então oligossacarídeos de um polissacarídeo de parede especial são liberados através de um hidrolase específica. Finalmente, a abundância relativa dos oligossacarídeos solúveis são determinados utilizando MALDI-TOF espectrometria de massa.
Figura 2. Abundância relativa de oligossacarídeos xiloglucano em plântulas estioladas de Arabidopsis, conforme determinado pelo OLIMP. A) Representante xiloglucano espectro de massa oligossacarídeo; cada íon representa uma estrutura específica de oligossacarídeos, isômeros estruturais não podem ser distinguidos. B) diagrama de barras correspondentes para a determinação da abundância relativa de oligossacarídeos.
Figura 3. Na análise OLIMP situ utilizando mudas estioladas de Arabidopsis como exemplo. Cada gota de enzima / digestão (círculos coloridos) podem ser analisados de forma independente e um espectro de massa correspondente podem ser obtidas e analisadas.
Figura 4. OLIMP espectro da xilana hemicelulose obtidos por digestão Miscanthus material da folha com uma xilanase (Megazyme).
Discussion
O método apresentado aqui OLIMP permite uma análise muito sensível e rápida de polímeros presentes nas matrizes extracelulares. OLIMP combina a liberação enzimática de oligômeros com a análise de MALDI-TOF subseqüentes. A geração de um espectro de MALDI-TOF leva menos de um minuto, daí OLIMP é adequado para uma ampla gama de aplicações, incluindo estudos de alto rendimento, como telas de mutantes. OLIMP não se restringe a polissacarídeos vegetais, mas pode potencialmente ser aplicada a uma ampla gama de polímeros, apenas limitada pela disponibilidade de enzimas hidrolíticas específicas. No entanto, uma limitação da OLIMP é que uma abundância absoluta de o polímero não pode ser obtida.
Como mencionado anteriormente OLIMP pode ser usado para estudar a estrutura de uma variedade de polissacarídeos presentes na matriz extracelular de uma diversidade de espécies. Como exemplo, a Figura 4 representa um espectro OLIMP da hemicelulose importante em espécies de gramíneas, xilana. Aqui, material da parede celular derivada da temperadas grama Miscanthus foi digerido utilizando uma xilanase.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela concessão do Energy Biosciences Institute OO0G01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL in water |
| BioRex MSZ 501(D) Resin | Bio-Rad | 142-7425 | |
| Endoglucanase | Megazyme | E-CELTR | |
| Xylanase M6 | Megazyme | E-XYRU6 | |
| 3mm metal balls | Retsch | 22.455.0011 | |
| Beat mill | Retsch | Mixer Mill MM400 | |
| MALDI-TOF | Shimadzu Corporation | Axima Performance | |
| MALDI target plate | Kratos Analytical | DE4555TA | |
| SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | |
| Vacuum manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | |
| Vacuum pump | Welch Allyn | DryFast Ultra 2032 |
References
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