وصفت وسيلة سريعة للحصول على نظرة ثاقبة لبنية السكريات في المصفوفة خارج الخلية. الأسلوب يستفيد من خصوصية وحساسية glycosylhydrolases من مطياف الكتلة يسمح تحليل كميات ضئيلة من المواد. هذا الأسلوب هو قابل للتكيف لاستخدامها مباشرة على النسيج نفسه.
وتوسط في اتصال مباشر من الخلايا للبيئة في العديد من الكائنات الحية عن طريق المصفوفة خارج الخلية. جانب واحد مشترك للمصفوفات خارج الخلية هو أنها تحتوي على جزيئات السكر معقدة في شكل جليكوبروتينات ، البروتيوغليكان ، و / أو السكريات. وتشمل الأمثلة على المصفوفة خارج الخلية من البشر والخلايا الحيوانية التي تتألف أساسا من البروتينات الليفية والبروتيوغليكان أو الجدران السكاريد خلية تقوم النباتات والفطريات ، وبروتيوغليكان / شحمي سكري جدران الخلايا تقوم البكتيريا. كل هذه glycostructures تلعب دورا حيويا في الخلية الى خلية الاتصال والخلية الى البيئة والإشارة.
مثال استثنائية معقدة من مصفوفة خارج الخلية موجودة في جدران خلايا النباتات الراقية. جدار مصنوع بالكامل تقريبا من السكريات ، وتصل إلى 75 ٪ من الوزن الجاف ، وتتكون من البوليمرات الحيوية الأكثر وفرة موجودة على هذا الكوكب. لذا ، يجري ابحاثا حول كيفية استخدام هذه المواد أفضل كمورد خالية من الكربون ليحل محل البتروكيماويات المتجددة المستمدة من الوقود الأحفوري. التحدي الرئيسي لتحويل الوقود لا يزال تمردات الجدران لتدهور الأنزيمية أو كيميائية بسبب glycostructures فريدة موجودة في هذا biocomposite فريدة من نوعها.
هنا ، نقدم طريقة لتحليل سريع وحساسة من glycostructures جدار الخلية النباتية. ويستند هذا الأسلوب الشامل أليغو التنميط (OLIMP) الافراج الأنزيمية من oligosaccharides من مواد الجدار تسهيل glycosylhydrolases محددة والتحليل اللاحق للمخاليط oligosaccharide solubilized باستخدام مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين وقت الرحلة الكتلة الطيفي (MALDI-TOF/MS ) 1 (الشكل 1). OLIMP يتطلب جدران الخلايا فقط 5000 لتحليل كامل ، لا يمكن أن يؤديها على النسيج نفسه 2 ، وغير قابلة للتحلل عالية الإنتاجية 3. بينما لا يمكن أن المبلغ المطلق للoligosaccharides solubilized يحددها OLIMP أن يرسم الوفرة النسبية للايونات في oligosaccharide مختلفة من الأطياف الشامل يعطي أفكارا حول نمط بدائل للالسكاريد الأصلية موجودة في الجدار.
يمكن استخدامها لتحليل OLIMP تشكيلة واسعة من البوليمرات الجدار ، وقلة فقط من توافر إنزيمات معينة 4. على سبيل المثال ، لتحليل البوليمرات الموجودة في جدار الخلية النباتية الانزيمات المتوفرة لتحليل xyloglucan hemicelluloses باستخدام xyloglucanase 5 ، 11 ، 12 ، 13 ، xylan باستخدام 6،7 إندو – β – (1-4) ، xylanase أو للحصول على السكريات بكتيني باستخدام مزيج من polygalacturonase وmethylesterase 8. وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام نفس مبادئ glycosylhydrolase OLIMP والأنشطة ناقلة الغليكوزيل حتى يتم رصدها وتحديد 9.
الأسلوب OLIMP المعروضة هنا يمكن تحليل حساسة للغاية وسريعة للبوليمرات موجودة في مصفوفات خارج الخلية. OLIMP يجمع الافراج الأنزيمية من oligomers مع تحليل MALDI – TOF اللاحقة. الجيل طائفة – TOF MALDI تستغرق أقل من دقيقة واحدة ، وبالتالي OLIMP هو مناسبة لمجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك دراسات الإنتاجية العالية مثل شاشات متحولة. لا يقتصر على OLIMP السكريات النباتية ولكن يحتمل أن يتم تطبيقها على مجموعة واسعة من البوليمرات ، وقلة فقط من توافر الإنزيمات حلمهي محددة. ومع ذلك ، وجود قيود OLIMP هو أنه لا يمكن مطلقا وفرة من البوليمر يمكن الحصول عليها.
كما ذكر من قبل ويمكن استخدام OLIMP لدراسة بنية مجموعة متنوعة من السكريات الموجودة في المصفوفة خارج الخلية من تنوع الأنواع. كمثال على ذلك ، الشكل 4 يمثل الطيف OLIMP هيميسيلولوز من الأنواع الرئيسية في العشب ، وxylan. هنا ، تم هضم المواد جدار الخلية المستمدة من العشب Miscanthus المعتدلة باستخدام xylanase.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل عن طريق منح OO0G01 طاقة معهد العلوم البيولوجية.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL in water | |
BioRex MSZ 501(D) Resin | BioRad | 142-7425 | ||
Endoglucanase | Megazyme | E-CELTR | ||
Xylanase M6 | Megazyme | E-XYRU6 | ||
3mm metal balls | Retsch | 22.455.0011 | ||
Beat mill | Retsch | Mixer Mill MM400 | ||
MALDI-TOF | Shimadzu BioTech | Axima Performance | ||
MALDI target plate | Kratos Analytical | DE4555TA | ||
SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | ||
Vacuum manifold | Millipore | MSVMHTS00 | ||
Vacuum pump | Welch | DryFast Ultra 2032 |