Eine schnelle Art und Weise beschrieben, Einblicke in die Struktur der Polysaccharide in einer extrazellulären Matrix zu gewinnen. Die Methode nutzt die Spezifität von Glykosylhydrolasen und die Empfindlichkeit der Massenspektrometrie ermöglicht winzige Mengen von Materialien analysiert werden. Diese Technik ist anpassungsfähig, um direkt auf das Gewebe selbst verwendet werden.
Der direkte Kontakt der Zellen für die Umwelt ist in vielen Organismen durch eine extrazelluläre Matrix vermittelt. Ein gemeinsamer Aspekt der extrazellulären Matrix ist, dass sie komplexe Zuckerreste in Form von Glykoproteinen, Proteoglykanen und / oder Polysaccharide enthalten. Beispiele hierfür sind die extrazelluläre Matrix des Menschen und tierischen Zellen, die hauptsächlich aus fibrillären Proteinen und Proteoglykanen oder Polysaccharid Zellwände von Pflanzen und Pilzen, und die Proteoglykan / Glycolipid Basis Zellwände von Bakterien. Alle diese Glykostrukturen spielen entscheidende Rollen in Zell-Zell-und Zell-zu-Umfeld Kommunikation und Signalisierung.
Eine außerordentliche komplexeres Beispiel für eine extrazelluläre Matrix ist in die Wände der höheren Pflanzenzellen. Ihre Wand ist fast ausschließlich aus Zucker gemacht, bis zu 75% Trockengewicht, und besteht aus den am häufigsten vorkommende Biopolymere präsentieren auf diesem Planeten. Daher ist die Forschung durchgeführt, wie diese Materialien am besten zu nutzen als eine Kohlenstoff-neutrale erneuerbare Ressource zu petrochemischen Produkten aus fossilen Brennstoffen gewonnen zu ersetzen. Die größte Herausforderung für Brennstoff Umwandlung bleibt die Widerspenstigkeit der Wände enzymatische oder chemische Abbau aufgrund der einzigartigen Glykostrukturen in dieser einzigartigen Biokomposit.
Hier stellen wir ein Verfahren zur schnellen und empfindlichen Analyse der pflanzlichen Zellwand Glykostrukturen. Diese Methode Oligo Messe Profiling (OLIMP) ist die enzymatische Freisetzung von Oligosacchariden aus Wandmaterialien Erleichterung spezifische Glykosylhydrolasen und anschließende Analyse der gelösten Oligosaccharid Mischungen unter Verwendung von Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation Time-of-flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF/MS Basis ) 1 (Abbildung 1). OLIMP erfordert Wände von nur 5000 Zellen für eine vollständige Analyse können auf das Gewebe selbst 2 durchgeführt werden, und ist zugänglich für High-Throughput-Analysen 3. Während die absolute Menge des gelösten Oligosaccharide können nicht durch OLIMP bestimmt die relative Häufigkeit der verschiedenen Oligosaccharid-Ionen aus den Massenspektren geben Einblicke über die Substitution-Muster der nativen Polysaccharid in der Wand abgegrenzt werden.
OLIMP kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Wand-Polymeren, die nur durch die Verfügbarkeit von bestimmten Enzymen 4 begrenzt zu analysieren. Zum Beispiel für die Analyse von Polymeren, die in der pflanzlichen Zellwand Enzyme sind für die Hemicellulosen Xyloglucan mit einem Xyloglucanase 5, 11, 12, 13, Xylan mit einem Endo-β-(1-4)-Xylanase 6,7 analysieren oder für Pektinstoffe Polysacchariden mit einer Kombination aus einer Polygalacturonase und Methylesterase 8. Darüber hinaus kann nach den gleichen Grundsätzen von OLIMP glycosylhydrolase und sogar Glycosyltransferase Aktivitäten überwacht und bestimmt werden 9.
Die OLIMP hier vorgestellte Methode ermöglicht eine sehr sensible und schnelle Analyse von Polymeren, die in der extrazellulären Matrix. OLIMP verbindet die enzymatische Freisetzung von Oligomeren mit anschließender MALDI-TOF-Analyse. Die Erzeugung eines MALDI-TOF-Spektrum dauert weniger als eine Minute, damit OLIMP ist geeignet für eine breite Palette von Anwendungen, einschließlich High-Throughput-Studien wie Mutantenscreens. OLIMP ist nicht auf pflanzliche Polysaccharide beschränkt, sondern kann potenziell ein breites Spektrum von Polymeren, die nur durch die Verfügbarkeit von bestimmten hydrolytische Enzyme beschränkt angewendet werden. Allerdings ist eine Beschränkung von OLIMP, dass eine absolute Fülle des Polymers nicht erreicht werden kann.
Wie bereits erwähnt OLIMP kann verwendet werden, um die Struktur einer Vielzahl von Polysacchariden in der extrazellulären Matrix von einer Vielfalt der Arten zu studieren. Als Beispiel stellt Abbildung 4 eine OLIMP Spektrum der wichtigsten Hemizellulose in Grasarten, Xylan. Hier wurde Zellwand Material aus den gemäßigten Gras Miscanthus abgeleitet verdaut mit einer Xylanase.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der Energy Biosciences Institute gewähren OO0G01 finanziert.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL in water | |
BioRex MSZ 501(D) Resin | BioRad | 142-7425 | ||
Endoglucanase | Megazyme | E-CELTR | ||
Xylanase M6 | Megazyme | E-XYRU6 | ||
3mm metal balls | Retsch | 22.455.0011 | ||
Beat mill | Retsch | Mixer Mill MM400 | ||
MALDI-TOF | Shimadzu BioTech | Axima Performance | ||
MALDI target plate | Kratos Analytical | DE4555TA | ||
SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | ||
Vacuum manifold | Millipore | MSVMHTS00 | ||
Vacuum pump | Welch | DryFast Ultra 2032 |