Summary
הדרך המהירה מתואר להשיג תובנות מבנה סוכרים מטריקס תאיים. השיטה מנצלת את הייחודיות של glycosylhydrolases ואת הרגישות של ספקטרומטריית מסה המאפשר כמויות זעירות של חומרים כדי להיות מנותח. טכניקה זו ניתנת להתאמה כדי לשמש ישירות על הרקמה עצמה.
Abstract
מגע ישיר של תאים בסביבה מתווכת באורגניזמים רבים על ידי מטריקס תאיים. היבט אחד משותף של מטריצות תאיים היא שהם מכילים סוכר moieties מורכבים בצורה של גליקופרוטאינים, proteoglycans, ו / או סוכרים. דוגמאות כוללות את תאי מטריקס של בני אדם ותאי בעלי חיים המורכב בעיקר חלבונים proteoglycans או סיבי פוליסכריד המבוסס קירות התא של צמחים ופטריות, ואת proteoglycan / glycolipid קירות התא של חיידקים מבוסס. כל glycostructures אלו ממלאים תפקידים חיוניים בתא אל התא תקשורת התא אל הסביבה איתות.
דוגמה יוצאת דופן של מטריצה מורכבת תאיים קיים קירות בתאי צמח גבוה יותר. הקיר שלהם מורכב רובו ככולו של סוכרים, עד 75% ממשקלה היבש, והוא מורכב biopolymers הנפוץ ביותר כיום על פני כדור הארץ. לכן, המחקר נערך כיצד לנצל את החומרים האלה בצורה הטובה ביותר משאב פחמן ניטרלי מתחדשת להחליף פטרוכימיה שמקורם בדלק מחצבי. האתגר העיקרי לגיור דלק נשאר סרבנות קירות השפלה אנזימטית או כימי בשל glycostructures ייחודי נוכח biocomposite ייחודי זה.
כאן, אנו מציגים שיטה לניתוח מהיר ורגיש של תא צמח glycostructures הקיר. שיטה זו המוניים אוליגו Profiling (OLIMP) מבוססת על שחרורו האנזימטית של אוליגוסכרידים מחומרים הקיר בהנחיית glycosylhydrolases ספציפיים ניתוח בדיעבד של תערובות oligosaccharide solubilized באמצעות מטריצה בעזרת לייזר desorption / יינון הזמן של הטיסה ספקטרומטריית מסה (MALDI-TOF/MS ) 1 (איור 1). OLIMP דורש קירות רק 5000 תאים לניתוח מלא, ניתן לבצע על הרקמה עצמה 2, ניתנת תפוקה גבוהה ניתוחים 3. אמנם הסכום המוחלט של אוליגוסכרידים solubilized לא ניתן לקבוע על ידי OLIMP השפע היחסי של יונים oligosaccharide השונים ניתן התחום מן הספקטרום המונית נותן תובנות לגבי דפוס, החלפה של פוליסכריד הילידים נוכח הקיר.
OLIMP ניתן להשתמש כדי לנתח מגוון רחב של פולימרים הקיר, מוגבל רק על ידי הזמינות של אנזימים ספציפיים 4. לדוגמה, לניתוח של פולימרים הנמצאים בתא אנזימים צמחיים הקיר זמינים לנתח את xyloglucan hemicelluloses באמצעות xyloglucanase 5, 11, 12, 13, xylan באמצעות Endo-β-(1-4), xylanase 6,7 , או סוכרים pectic באמצעות שילוב של polygalacturonase לבין methylesterase 8. יתר על כן, באמצעות אותם עקרונות של OLIMP glycosylhydrolase ואפילו פעילויות glycosyltransferase ניתן לנטר נקבע 9.
Protocol
השיטה OLIMP מודגמת על hemicellulose הגדולות להציג את קירות התא של צמחים dicot, xyloglucan, באמצעות endoglucanase כמו glycosylhydrolase. השיטה הוכיחה עם שתילים ארבידופסיס כולו כמקור רקמות הצמח. חומר מטריקס ו אנזימים תאיים ניתן להחליף בהתאם לניתוח המבוקש באמצעות ההליך אותו.
1. קיר בידוד נייד
- Five קציר 5 ימים שתילים הישן ארבידופסיס כולו או כמות שווה של החומר הרצוי ולהעביר אותם לתוך צינור התגובה 1.5mL. ודא כי חומר ממוקם בתחתית הצינור.
- הוספת שני כדורי מתכת 3mm אל הצינור תגובה על גבי המדגם Snap-להקפיא בחנקן נוזלי.
- טוחנים את המדגם קפואים באמצעות כדור הטחנה (02:30 דק ', 25Hz).
- הוסף 1mL אתנול מימית 70% מהמדגם. הסר את כדורי מתכת באמצעות מגנט. וורטקס ביסודיות.
- צנטריפוגה מדגם בסל"ד 14,000 עבור 10min כדי גלולה שאריות אלכוהול מסיס המכיל את החומר דופן התא.
- הסר בזהירות את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה.
- הוסף 1mL של פתרון כלורופורם / מתנול (01:01 v / v). וורטקס ביסודיות כדי resuspend גלולה.
- צנטריפוגה מדגם בסל"ד 14,000 עבור 10 דקות ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה.
- יבש את הדגימה באמצעות concentrator.
2. Solubilization של אוליגוסכרידים
- עבור solubilization את פוליסכריד בפרט בצורה של אוליגוסכרידים שלה resuspend גלולה יבש 25μl של המאגר המתאים. עבור formate אמוניום endoglucanase 50mm, pH4.5, משמש. הוסף 0.2U של endoglucanase. ההשעיה וורטקס נוזל ספין למטה.
- דגירה המדגם עבור 16h ב 37 ° C באינקובטור, רועד בכל 300rpm.
- הסר את הממס של לעכל (מים) באמצעות concentrator.
3. MALDI-TOF ניתוח של אוליגוסכרידים שוחרר
- BioRex MSZ בתמורה 501 קטיון חרוזים שרף משמשים כדי להסיר מלחים האנזים מן המדגם מעוכל. מצבם חרוזים ידי הצבת aliquot בעמודה ריקה כביסה החרוזים עם כמויות של מים.
- הוסף 5-10 חרוזים BioRex המדגם מתעכל מיובשים. ואז להוסיף מים 10μl, עבור כמויות קטנות יותר של חומר 5μl המים עשויים לשמש. לטבול את החרוזים בפתרון על ידי לחיצה קצרה מסובב את הצינור. דגירה לפחות 10min בטמפרטורת החדר.
- ספוט 2μl מטריקס (2,5-dihydroxybenzoic חומצה (DHB), 10mg/ml במים) לצלחת יעד MALDI. להתאדות המטריצה ממס תחת ואקום המוביל גבישים כימיים הומוגני מטריצה.
- ספוט 2μl הפתרון מדגם desalted על גבי מטריצת הגבישים בצלחת היעד.
אם אתה רוצה לזהות מספר גדול של דגימות רק לשמור על תצפית לכל היותר 3min. הפעם מסגרת מבטיח כי הדוגמה הראשונה הבחינו לא יבש עדיין. חכו 2min נוסף כדי להבטיח ערבוב יסודי של מטריקס מחדש מומס ומולקולות מדגם oligosaccharide במדגם הבחין האחרון. לאחר מכן יבש את הצלחת למקד תחת ואקום.
תמהיל המדגם / מטריצה צריך להתגבש תוך פחות 1min כדי לאפשר התגבשות הומוגנית. - מניחים צלחת לתוך היעד ספקטרומטר MALDI-TOF המוני. המכשיר צריך להיות מוגדר במצב reflectron חיובי עם מתח מואץ של 20000V ו עיכוב של 350 ננומטר, את טווח המוני שנבחר צריך להיות 500-3000 דא (עשוי להשתנות תלוי oligomers צפוי). התחל ירי הלייזר ולאסוף 100-200 ספקטרה לפי המדגם, אשר נערך כדי ליצור ספקטרום נציג הממוצע (איור 2 א). יונים המייצג אוליגוסכרידים ספציפי ניתן לזהות על ידי המסה שלהם על יחס תשלום (m / z). עוצמות יון (גובה שיא) של כל היונים של עניין יש להוסיף עד 100% וכתוצאה מכך השפע היחסי של כל oligosaccharide במדגם (2B איור).
4. בניתוח OLIMP באתרו
OLIMP יכול לשמש גם ישירות על רקמת השמטת כל צעד בהכנת הקיר. כדוגמה מולבן hypocotyls של ארבידופסיס כמקור רקמות הצמח משמשים. שוב, endoglucanase משמש כדי לקבוע את המבנה של xyloglucan hemicelluloses. אנזימים וחומרים רקמה ניתן להחליף בהתאם לניתוח המבוקש באמצעות ההליך אותו.
- קציר שתיל מולבן ולמקם אותו לצלחת MALDI ריק היעד ולתת הנבט יבש.
- הוסף 0.5μl endoglucanase (0.4U/μl, מומס formate אמוניום 50mm, pH4.5) על הנבט יבש במיקום הרצוי. ודא כי ירידה אנזים נוגע חלקית את הצלחת היעד.
- מניחים את צלחת היעד MALDI בכלי סגור עם לחות להרוות להימנע כי הירידה אנזים מתייבש. דגירה את הצלחת בחדר עבור 16 שעות ב 37 ° C.
- יבש את הצלחת היעד MALDI עם רקמות הצמח לבין ירידה אנזים תחת ואקום.
- הוסף 0.5μl מטריקס (DHB: 10 מ"ג / ליטר) על גבי כל מקום אנזים יבשים. תן לזה לעמוד 2min.
- יבש את הצלחת היעד MALDI תחת ואקום.
- ניתוח דגימות עם MALDI-TOF. מניחים צלחת עם רקמת היעד ואת המקום אנזים / מטריקס (ים) לתוך הספקטרומטר MALDI-TOF המוני. המכשיר צריך להיות מוגדר במצב reflectron חיובי עם מתח מואץ של 20000V ו עיכוב של 350 ננומטר, את טווח המוני שנבחר צריך להיות 500-3000 דא (עשוי להשתנות תלוי oligomers צפוי).
- התחל ירי הלייזר על גבי המטריצה / מדגם גבישים הבא לרקמה. הקפד לא לפגוע ברקמה עצמה, במקרה כזה את זמן הטיסה של מולקולות יהיה משם. איסוף סביב 20-50 ספקטרה לכל נקודה, אשר מופקים כדי ליצור ספקטרום נציג הממוצע (איור 3). יונים המייצג אוליגוסכרידים ספציפי ניתן לזהות על ידי המסה שלהם על יחס תשלום (m / z). עוצמות יון (יון גובה) ניתן לדווח על כל עניין יונים יש להוסיף עד 100% וכתוצאה מכך השפע היחסי של כל אוליגוסכרידים במדגם.
5. נציג תוצאות
דוגמה לניתוח OLIMP של xyloglucan hemicelluloses נוכח שתילים ארבידופסיס מוצג באיור 2. בשל הבדלי המסה של יונים לבין האנזים מאופיין היטב ידוע (endoglucanase) סגוליות היונים ניתן להקצות מבנים oligosaccharide ספציפי (איור 2 א). ברור, איזומרים מבניים לא ניתן להבחין. הנחת היסוד לקביעת השפע היחסי של אוליגוסכרידים שונים (תרשים 2B) הוא מפרט המסה שלהם גורם לתגובה דומה מאוד עבור אוליגוסכרידים אלה. כפי שמוצג כאן, כימות OLIMP ניתנת לשחזור מאוד. עם זאת, יש לציין כי חוסנו של השיטה תלויה מאוד האות יחס רעש של יוני oligosaccharide שונים. לדוגמה זיהום עם מלחים או כמויות נמוכות של אוליגוסכרידים יכול להקטין את היחס.
ניתוח OLIMP על הרקמה עצמה (בניתוח באתרו) מאפשר לימוד של אזורים קטנים מאוד מוגדרים כולל הכנת המדגם מעט מאוד. בדוגמה המוצגת כאן (איור 3) לא איכותי (יונים זהה) אך הבדלים כמותיים (וריאציה ב בעוצמות יון) נצפו בין הצילומים ואת השורש של רקמות הנבט ארבידופסיס. צירופים של שיטת-OLIMP יכול ובכך להוביל "הדמיה" רקמה.
באיור 1. תרשים זרימה של הליך OLIMP באמצעות שתילים ארבידופסיס כולו כמקור צמח. ראשית, הרקמה macerated קיר התא חומר מוכן (תמונה שונה מן Fujino et al. 10). ואז אוליגוסכרידים של פוליסכריד קיר מסוים משתחררים באמצעות hydrolase ספציפיים. לבסוף, שכיחותם היחסית של אוליגוסכרידים מסיסים נקבעים באמצעות MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה.
איור 2. השפע היחסי של אוליגוסכרידים xyloglucan ב שתילים מולבן מ ארבידופסיס כפי שנקבע על ידי OLIMP. א) נציג xyloglucan oligosaccharide מסה ספקטרום; יון מייצג מבנה oligosaccharide ספציפי, איזומרים מבניים לא ניתן להבחין. ב) בר תרשים מקבילים להגדרה של שפע oligosaccharide יחסית.
איור 3. בניתוח OLIMP באתרו באמצעות שתילים מולבן של ארבידופסיס כדוגמה. אגל כל אנזים / עיכול (מעגלים צבעוניים) ניתן לנתח באופן עצמאי ספקטרה המונית המקביל ניתן להשיג ולנתח.
איור 4. הספקטרום OLIMP של xylan hemicellulose מתקבל על ידי לעכל חומר Miscanthus עלה עם xylanase (Megazyme).
Discussion
השיטה המוצגת כאן OLIMP מאפשר ניתוח רגיש מאוד ומהירה של פולימרים נוכח מטריצות תאיים. OLIMP משלב את שחרור האנזימטית של oligomers עם ניתוח MALDI-TOF הבאים. הדור של הספקטרום MALDI-TOF לוקח פחות מדקה, ולכן OLIMP מתאים למגוון רחב של יישומים, כולל תפוקה גבוהה מחקרים כגון מסכי מוטציה. OLIMP אינו מוגבל סוכרים צמח אך עלולה להיות מיושם על מגוון רחב של פולימרים, מוגבל רק על ידי הזמינות של אנזימים hydrolytic ספציפיים. עם זאת, מגבלה של OLIMP הוא שפע מוחלט של הפולימר לא ניתן להשיג.
כפי שהוזכר קודם לכן OLIMP ניתן להשתמש כדי ללמוד את המבנה של מגוון רחב של סוכרים המצויים המטריצה תאיים של מגוון המינים. כדוגמה, איור 4 מייצג ספקטרום OLIMP של hemicellulose העיקרי מינים הדשא, xylan. כאן, דופן התא חומר הנגזר הדשא Miscanthus ממוזג היה מתעכל באמצעות xylanase.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי OO0G01 להעניק Biosciences לאנרגיה של המכון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL in water |
| BioRex MSZ 501(D) Resin | Bio-Rad | 142-7425 | |
| Endoglucanase | Megazyme | E-CELTR | |
| Xylanase M6 | Megazyme | E-XYRU6 | |
| 3mm metal balls | Retsch | 22.455.0011 | |
| Beat mill | Retsch | Mixer Mill MM400 | |
| MALDI-TOF | Shimadzu Corporation | Axima Performance | |
| MALDI target plate | Kratos Analytical | DE4555TA | |
| SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | |
| Vacuum manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | |
| Vacuum pump | Welch Allyn | DryFast Ultra 2032 |
References
- Lerouxel, O. Rapid structural phenotyping of plant cell wall mutants by enzymatic oligosaccharide fingerprinting. Plant Physiology. 130 (4), 1754-1754 (2002).
- Obel, N. Microanalysis of plant cell wall polysaccharides. Molecular Plant. 2 (5), 922-922 (2009).
- Mouille, G. Quantitative trait loci analysis of primary cell wall composition in Arabidopsis. Plant Physiology. 141 (3), 1035-1035 (2006).
- Bauer, S. Development and application of a suite of polysaccharide-degrading enzymes for analyzing plant cell walls. PNAS. 103 (30), 11417-11417 (2006).
- Pauly, M. A xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus: expression cloning in yeast, purification and characterization of the recombinant enzyme. Glycobiology. 9 (1), 93-93 (1999).
- Aboughe-Angone, S. Cell wall carbohydrates from fruit pulp of Argania spinosa: structural analysis of pectin and xyloglucan polysaccharides. Carbohydr Res. 343 (1), 67-67 (2008).
- Brown, D. M. Comparison of five xylan synthesis mutants reveals new insight into the mechanisms of xylan synthesis. Plant Journal. 52 (6), 1154-1154 (2007).
- Lee, C. The PARVUS gene is expressed in cells undergoing secondary wall thickening and is essential for glucuronoxylan biosynthesis. Plant Cell Physiol. 48 (12), 1659-1659 (2007).
- Obel, N. Pectin may hinder the unfolding of xyloglucan chains during cell deformation: implications of the mechanical performance of Arabidopsis hypocotyls with pectin alterations. Molecular Plant . , (2009).
- Cavalier, D. M., Keegstra, K. Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).
- Leonard, R. Identification of an Arabidopsis gene encoding a GH95 alpha1,2-fucosidase active on xyloglucan oligo- and polysaccharides. Phytochemistry. 69 (10), 1983-1983 (2008).
- Cavalier, D. M., Keegstra, K. Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).
- Lee, C. H. The irregular xylem9 mutant is deficient in xylan xylosyltransferase activity. Plant and Cell Physiology. 48 (11), 1624-1624 (2007).
- Iglesias, N. Apoplastic glycosidases active against xyloglucan oligosaccharides of Arabidopsis thaliana. Plant and Cell Physiology. 47 (1), 55-55 (2006).
- Fujino, T., Sone, Y., Mitsuishi, Y., Itoh, T. Characterization of cross-links between cellulose microfibrils, and their occurrence during elongation growth in pea epicotyl. Plant Cell Physiol. 41 (4), 486-486 (2000).
- Vanzin, G. F. The mur2 mutant of Arabidopsis thaliana lacks fucosylated xyloglucan because of a lesion in fucosyltransferase AtFUT1. PNAS. 99 (5), 3340-3340 (2002).
- Cavalier, D. M. Disrupting two Arabidopsis thaliana xylosyltransferase genes results in plants deficient in xyloglucan, a major primary cell wall component. Plant Cell. 20 (6), 1519-1519 (2008).
- Hilz, H. A comparison of liquid chromatography, capillary electrophoresis, and mass spectrometry methods to determine xyloglucan structures in black currants. Journal of Chromatography A. 1133 (1-2), 275-275 (2006).
- Pauly, M. Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells. Planta. 214 (1), 67-67 (2001).
