Uma maneira rápida é descrito para obter insights sobre a estrutura de polissacarídeos em uma matriz extracelular. O método aproveita a especificidade do glycosylhydrolases ea sensibilidade da espectrometria de massa permitindo que pequenas quantidades de materiais a serem analisados. Esta técnica é adaptável para ser usada diretamente sobre o tecido em si.
O contato direto das células para o meio ambiente é mediada, em muitos organismos por uma matriz extracelular. Um aspecto comum de matrizes extracelulares é que eles contêm metades açúcar complexo em forma de glicoproteínas, proteoglicanos e / ou polissacarídeos. Exemplos incluem a matriz extracelular dos seres humanos e células animais que consiste principalmente de proteínas fibrilares e proteoglicanos ou o polissacarídeo paredes à base de células de plantas e fungos, e os proteoglicanos / glicolipídeo paredes à base de células de bactérias. Todos estes glycostructures desempenham um papel vital na célula-célula de comunicação e de células-to-ambiente e de sinalização.
Um exemplo extraordinário complexo de uma matriz extracelular está presente nas paredes das células de plantas superiores. Sua parede é feito quase inteiramente de açúcares, até 75% do peso seco, e consiste dos biopolímeros mais abundantes presentes no planeta. Portanto, a pesquisa é conduzida como utilizar esses materiais melhores como um recurso de carbono neutro renováveis para substituir derivados petroquímicos de combustíveis fósseis. O principal desafio para a conversão de combustível permanece a recalcitrância de paredes à degradação enzimática ou química, devido à glycostructures única presente neste biocomposite único.
Aqui, apresentamos um método para a análise rápida e sensível da planta glycostructures parede celular. Este método Profiling Massa Oligo (OLIMP) baseia a liberação enzimática de oligossacarídeos a partir de materiais de parede facilitar glycosylhydrolases específica e posterior análise das misturas de oligossacarídeos solubilizada usando matrix-assisted laser de dessorção / ionização de tempo de vôo espectrometria de massa (MALDI-TOF/MS ) 1 (Figura 1). OLIMP exige paredes de apenas 5.000 células para uma análise completa, pode ser realizada no próprio tecido 2, e é passível de high-throughput análises 3. Embora a quantidade absoluta do oligossacarídeos solubilizados não pode ser determinado por OLIMP a abundância relativa dos íons vários oligossacarídeos pode ser delineada a partir dos espectros de massa dando insights sobre a substituição de padrões do polissacarídeo nativo presente na parede.
OLIMP pode ser usado para analisar uma grande variedade de polímeros de parede, limitada apenas pela disponibilidade de enzimas específicas 4. Por exemplo, para a análise de polímeros presentes na planta enzimas da parede celular estão disponíveis para analisar o xiloglucano hemiceluloses usando um xyloglucanase 5, 11, 12, 13, xilana usando uma endo-β 6,7 (1-4)-xilanase , ou para polissacarídeos pécticos utilizando uma combinação de uma poligalacturonase e um methylesterase 8. Além disso, usando os mesmos princípios de OLIMP glycosylhydrolase e até mesmo atividades glicosiltransferase podem ser monitorados e determinados 9.
O método apresentado aqui OLIMP permite uma análise muito sensível e rápida de polímeros presentes nas matrizes extracelulares. OLIMP combina a liberação enzimática de oligômeros com a análise de MALDI-TOF subseqüentes. A geração de um espectro de MALDI-TOF leva menos de um minuto, daí OLIMP é adequado para uma ampla gama de aplicações, incluindo estudos de alto rendimento, como telas de mutantes. OLIMP não se restringe a polissacarídeos vegetais, mas pode potencialmente ser aplicada a uma ampla gama de polímeros, apenas limitada pela disponibilidade de enzimas hidrolíticas específicas. No entanto, uma limitação da OLIMP é que uma abundância absoluta de o polímero não pode ser obtida.
Como mencionado anteriormente OLIMP pode ser usado para estudar a estrutura de uma variedade de polissacarídeos presentes na matriz extracelular de uma diversidade de espécies. Como exemplo, a Figura 4 representa um espectro OLIMP da hemicelulose importante em espécies de gramíneas, xilana. Aqui, material da parede celular derivada da temperadas grama Miscanthus foi digerido utilizando uma xilanase.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pela concessão do Energy Biosciences Institute OO0G01.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL in water | |
BioRex MSZ 501(D) Resin | BioRad | 142-7425 | ||
Endoglucanase | Megazyme | E-CELTR | ||
Xylanase M6 | Megazyme | E-XYRU6 | ||
3mm metal balls | Retsch | 22.455.0011 | ||
Beat mill | Retsch | Mixer Mill MM400 | ||
MALDI-TOF | Shimadzu BioTech | Axima Performance | ||
MALDI target plate | Kratos Analytical | DE4555TA | ||
SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | ||
Vacuum manifold | Millipore | MSVMHTS00 | ||
Vacuum pump | Welch | DryFast Ultra 2032 |