Summary
Bir ekstrasellüler matriks polisakkaritlerin yapısına anlayışlar kazanmak için hızlı bir şekilde açıklanmıştır. Yöntemi dakika miktarda malzeme analiz edilmesi için izin kütle spektrometresi glycosylhydrolases özgüllüğü ve duyarlılığı yararlanır. Bu teknikte doku kendisini doğrudan kullanılmak üzere uyarlanabilir.
Abstract
Çevre hücreleri doğrudan temas ekstraselüler matriks tarafından birçok organizmalarda aracılık eder. Ekstrasellüler matrisler bir ortak yönü glikoproteinlerin şeklinde kompleks şeker moieties proteoglikanlar ve / veya polisakkaritler içerir. Örnekler, fibriler protein ve proteoglikanlar veya bitki ve mantar hücre duvarları polisakkarit başlıca oluşan insan ve hayvan hücreleri ekstrasellüler matriks ve proteoglikan / bakteri hücre duvarlarının glikolipid içerir. Tüm bu glycostructures hücre-hücre ve hücre-çevre haberleşme ve sinyalizasyon hayati rol oynamaktadır.
Ekstraselüler matriks bir olağanüstü karmaşık bir örnek yüksek bitki hücrelerinin duvarları mevcut. Onların duvar şekerlerin kuru ağırlığının% 75 kadar, neredeyse tamamen, ve bu gezegen üzerindeki en bol biyopolimerlerin oluşur. Bu nedenle, araştırma, fosil yakıt elde edilen petrokimya yerine karbon-nötr bir yenilenebilir kaynak olarak en iyi bu malzemelerin nasıl kullanılacağını yapılır. Yakıt dönüşümü için temel zorluk, bu eşsiz biokompozit benzersiz glycostructures nedeniyle enzimatik veya kimyasal bozunmaya duvarların dinlemezlik kalır.
Burada, bitki hücre duvarının glycostructures hızlı ve hassas bir analiz için bir yöntem mevcut. Bu yöntem, oligo Kitle Profil (Olimp) (MALDI-TOF/MS matriks yardımlı lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman-uçuş-kütle spektrometresi kullanarak özel glycosylhydrolases ve çözündüğünü oligosakkarit karışımları sonraki analizi kolaylaştırmak duvar malzemeleri oligosakkaritler enzimatik serbest dayanır 1) (Şekil 1). Olimp, tam bir analiz için sadece 5000 hücrelerinin duvarları, doku kendisini 2 yapılabilir gerektirir ve yüksek verimlilik analizleri 3 için uygun . Mutlak miktarda çözünür oligosakkaritler Olimp tarafından belirlenir mümkün olmasa bile, çeşitli oligosakkarit iyonların göreceli bolluk, duvarda bulunan yerli bir polisakkarit ikame model hakkında anlayışlar veren kitle spektrumu tarif edilebilir.
Olimp sadece belirli enzimler 4 durumu ile sınırlı duvar polimerlerin geniş bir yelpazede, analiz için kullanılabilir. Örneğin, bitki hücre duvarı enzimler bulunan polimerlerin analizi için bir endo-β-(1-4)-xylanase 6,7 kullanarak xyloglucanase 5, 11, 12, 13, Xylan kullanarak hemiselülozlar xyloglucan analiz etmek için kullanılabilir. veya polygalacturonase ve methylesterase 8 bir arada kullanarak pektik polisakkaritler. Ayrıca, aynı ilkeler Olimp glycosylhydrolase ve hatta glycosyltransferase faaliyetleri izlenir ve 9 tespit edilebilir.
Protocol
Olimp yöntemi glycosylhydrolase olarak endoglucanase kullanarak, dikotil bitkiler, xyloglucan hücre duvarlarında bulunan başlıca hemiselüloz örneklediği. Bu yöntem bir bitki doku kaynağı olarak tüm Arabidopsis fideler ile gösterilmiştir. Enzim ve hücre dışı matriks malzemesi, aynı prosedür kullanılarak istenilen analiz bağlı olarak değiştirilebilir.
1. Hücre duvar izolasyonu
- Hasat beş 5 gün eski tüm Arabidopsis fide veya eşdeğer miktarda istenilen malzemenin ve 1.5mL bir reaksiyon tüpü içine aktarabilirsiniz . Malzeme tüp alt yerleştirildiğinden emin olun.
- Sıvı nitrojen içinde örnek ve ek-freeze üst üste iki 3mm metal topları reaksiyon tüpüne ekleyin.
- Bilyalı değirmen (02:30 dakika, 25Hz) kullanılarak dondurulmuş örnek Grind.
- Örnek 1 ml% 70 sulu etanol ekleyin. Bir mıknatıs kullanarak metal topları çıkarın. Iyice Vortex.
- Pelet için 10dk hücre duvarı malzemesi içeren alkol çözünmeyen kalıntı 14.000 rpm'de örnek santrifüjleyin.
- Aspirasyon ile süpernatantı dikkatlice çıkarın. Pelet rahatsız değil emin olun.
- Kloroform / metanol (1:1 v / v) solüsyonu 1 ml ekleyin. Pelletini tekrar iyice karıştırın.
- Örnek 10 dakika 14.000 rpm'de santrifüj ve dikkatli bir aspirasyon ile süpernatantı kaldırmak. Pelet rahatsız değil emin olun.
- Örnek bir konsantratör kullanarak kurutun.
2. Oligosakkaritlerin çözünürleştirme
- Oligosakkaritler şeklinde çözünürleştirme için özellikle polisakkarit uygun bir tampon 25μl kuru pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Endoglucanase 50mm Amonyum format, pH4.5 için kullanılır. Endoglucanase, 0.2U ekleyin. Vorteks aşağı süspansiyon ve spin sıvı.
- 37 16h için örnek inkübe ° C bir kuluçka makinesi, 300rpm az sallayarak.
- Konsantratör kullanarak sindirmek (su) çözücü çıkarın.
3. MALDI-TOF analizi yayımlanan oligosakkaritler
- BioRex MSZ 501 katyon değişim reçine boncuk sindirilir örnek tuzları ve enzim kaldırmak için kullanılır. Boş bir sütun yerleştirme ve bir kısım boncuk bol miktarda su ile yıkama Durumu boncuk.
- 5-10 BioRex boncuk sindirilir ve kurutulmuş örnek ekleyin. Sonra küçük miktarlarda su malzeme 5μl olabilir, 10μl su ekleyin. Kısaca tüp iplik çözüm boncuk bırakın. Oda sıcaklığında en az 10 dakika süreyle inkübe edin.
- MALDI hedef plaka üzerine Spot 2μl matris (2,5-dihydroxybenzoic asit (DHB), su 10mg/ml). Homojen matris kimyasal kristalleri giden vakum altında çözücü matris buharlaşır.
- Spot 2μl hedef plakası matris kristallerin üst desalted örnek çözümü.
Örnekleri çok sayıda nokta istiyorsanız sadece 3dk maksimum lekelenme devam. Bu zaman çerçevesi ilk benekli örnek henüz kuru olduğunu garanti eder. Son benekli örnek yeniden çözünmüş matris ve örnek oligosakkarit molekülleri tam bir karıştırma sağlamak için ek bir 2min için bekleyin. Sonra kuru bir vakum altında hedef plakası.
Örnek / matris karışımı homojen kristalizasyon etkinleştirmek için 1dk daha az kristalize gerekir. - Hedef plakası MALDI-TOF kütle spektrometresi içine yerleştirin. Makine 20000V hızlanan voltaj ve 350 nm arasında bir gecikme ile olumlu reflectron moduna ayarlanmış olmalıdır seçilen kütle aralığı (olabilir beklenen oligomerler bağımlı değiştirmek) 500-3000 Da olmalıdır. Lazer ateş başlayın ve bir temsilcisi ortalama spektrumu (Şekil 2A) oluşturmak için derlenmiş örnek başına 100-200 spektrumları, toplamak. Belirli oligosakkaritler temsil İyonlar şarj (m / z) oranı üzerinden kitle tarafından tespit edilebilir. Tüm ilgi çekici iyonlarının iyon yoğunlukları (pik yükseklik) örnek her oligosakkarit göreceli bolluk (Şekil 2B)% 100'e kadar ilave edilmelidir.
4. yerinde Olimp analizi
Olimp dokusu üzerinde herhangi bir duvar hazırlık adımları atlayarak doğrudan da kullanılabilir. Bitki doku kaynağı olarak bir örnek Arabidopsis, hypocotyls solmuş. Yine, bir endoglucanase hemiselülozlar xyloglucan yapısını belirlemek için kullanılır. Enzim ve doku malzemesi aynı prosedür kullanılarak istenilen analiz bağlı olarak değiştirilebilir.
- Solmuş fide Hasat ve boş bir MALDI hedef plaka üzerine koyun ve fide kurumaya bırakın.
- Istenilen konuma kuru fide 0.5μl endoglucanase (50mm Amonyum format içinde çözünmüş 0.4U/μl, pH4.5) ekleyin. Enzim damla hedef plakası kısmen dokunur emin olun.
- Doyurarak nem önlemek için kapalı bir kapta MALDI hedef plaka koyun enzim damla kurur. 1 odasında plaka inkübeAz 6 saat 37 ° C
- Bitki doku ve vakum altında enzim damla MALDI hedef plakası kurulayın.
- Her kuru enzim spot üstünde; 0.5μl matrisi (10 mg / l DHB) ekleyin. 2min için bekletin.
- Vakum altında MALDI hedef plakası kurulayın.
- MALDI-TOF örnekleri analiz edin. MALDI-TOF kütle spektrometresi içine doku ve enzim / matris spot (ler) ile hedef plakası yerleştirin. Makine 20000V hızlanan voltaj ve 350 nm arasında bir gecikme ile olumlu reflectron moduna ayarlanmış olmalıdır seçilen kütle aralığı (olabilir beklenen oligomerler bağımlı değiştirmek) 500-3000 Da olmalıdır.
- Doku SONRAKİ matris / örnek kristalleri üzerine lazer ateş başlayın. Zaman moleküller uçuş kapalı olacaktır Böyle bir durumda, doku kendisi basmayın emin olun. Nokta, bir temsili ortalama spektrumu (Şekil 3) oluşturmak için derlenmiş başına yaklaşık 20-50 spektrumları toplayın. Belirli oligosakkaritler temsil İyonlar şarj (m / z) oranı üzerinden kitle tarafından tespit edilebilir. Iyon yoğunlukları (iyon yükseklik) olabilir ve tüm ilgi çekici iyonları örnek her oligosakkaritler göreceli bolluk içinde% 100 ilave edilmelidir.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Arabidopsis fide hemiselülozlar xyloglucan Olimp analizinin bir örneği Şekil 2'de gösterilmiştir. Iyonlarının kütle farklılıkları ve bilinen iyi karakterize bir enzim sayesinde (endoglucanase) özgüllüğü iyonları özel oligosakkarit yapılar (Şekil 2A) atanabilir. Açıkçası, yapısal izomerleri ayırt edilemez. Belirlenmesi için çeşitli oligosakkaritler göreceli bolluk temel varsayım (Şekil 2B), kitlesel spec tepki faktörü bu oligosakkaritler için çok benzer olmasıdır. Burada görüldüğü gibi, Olimp kantifikasyon yüksek tekrarlanabilir. Bununla birlikte, yöntemin sağlamlık sinyali çeşitli oligosakkarit iyonları gürültü oranları son derece bağımlı olduğunu lütfen unutmayın. Örneğin bu oran düşük miktarlarda tuz veya oligosakkaritler ile kirlenme azaltabilirsiniz.
Olimp doku (in situ analizi) analizi, çok küçük ve belirli alanlarda çalışma sağlar ve çok az numune hazırlama içerir. Örneğin aynı kalitatif (iyonlar) (Şekil 3) Burada sunulan ancak kantitatif farklılıklar (iyon şiddetleri değişimi) Arabidopsis fide sürgün ve kök doku arasında gözlendi. Olimp yöntemi Permütasyonlar böylece doku "görüntüleme" yol açabilir.
Şekil 1: Akış şeması bir bitki kaynağı olarak tüm Arabidopsis fide kullanarak Olimp prosedürü. İlk olarak, doku yumuşatılır ve hücre duvarı malzemesi (resim, Fujino ve ark modifiye 10) hazırlanır. Sonra belirli bir hidrolaz kullanarak belirli bir duvar polisakkarit oligosakkaritler serbest bırakılır. Son olarak, çözünür oligosakkaritler bağıl bollukları MALDI-TOF kütle spektrometresi ile belirlenir.
Şekil 2 Olimp tarafından belirlenir Arabidopsis solmuş fide xyloglucan oligosakkaritler göreceli bolluk. A) Temsilci xyloglucan oligosakkarit kütle spektrumu, her iyon belirli bir oligosakkarit yapısını temsil eder, yapısal izomerleri ayırt edilebilir değildir. B) belirlenmesi için, göreceli oligosakkarit bolluk Sorumlu çubuk diyagramı.
Şekil 3 Örnek olarak Arabidopsis solmuş fide kullanarak yerinde Olimp analiz. Her enzim / sindirim damlacık (renkli daireler) bağımsız olarak analiz edilebilir ve buna karşılık gelen bir kütle spektrumları elde edilir ve analiz edilebilir.
Şekil 4. Xylanase (Megazyme) Miscanthus yaprak malzeme sindirerek elde hemiselüloz Xylan Olimp spektrumu.
Discussion
Burada sunulan Olimp yöntemi ekstrasellüler matrisler bulunan polimerlerin çok hassas ve hızlı analiz sağlar. Olimp enzimatik sonraki MALDI-TOF analizi ile oligomerler sürümü birleştirir. MALDI-TOF yelpazenin nesil bir dakikadan az sürer, dolayısıyla Olimp mutant ekranlar gibi yüksek verimli çalışmaları da dahil olmak üzere geniş bir uygulama yelpazesi için uygundur. Olimp bitki polisakkaritler ile sınırlı değildir ancak potansiyel olarak sadece özel hidrolitik enzimlerin durumu ile sınırlı polimerler, geniş bir yelpazede uygulanabilir. Ancak, Olimp bir sınırlama polimer mutlak bir bereket elde edilemez.
Olimp çeşitli türlerin çeşitliliği ekstraselüler matriks polisakkaritlerin yapısını incelemek için, kullanılmadan önce de belirtildiği gibi. Bir örnek olarak, Şekil 4, ot türleri başlıca hemiselüloz, Xylan bir Olimp spektrum temsil eder. Burada, hücre duvar malzemesi ılıman çim Miscanthus türetilmiş bir xylanase kullanılarak sindirilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Enerji Enstitüsü Biosciences hibe OO0G01 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 37550 | 10mg/mL in water |
| BioRex MSZ 501(D) Resin | Bio-Rad | 142-7425 | |
| Endoglucanase | Megazyme | E-CELTR | |
| Xylanase M6 | Megazyme | E-XYRU6 | |
| 3mm metal balls | Retsch | 22.455.0011 | |
| Beat mill | Retsch | Mixer Mill MM400 | |
| MALDI-TOF | Shimadzu Corporation | Axima Performance | |
| MALDI target plate | Kratos Analytical | DE4555TA | |
| SpeedVac | Eppendorf | Vacufuge 5301 | |
| Vacuum manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | |
| Vacuum pump | Welch Allyn | DryFast Ultra 2032 |
References
- Lerouxel, O. Rapid structural phenotyping of plant cell wall mutants by enzymatic oligosaccharide fingerprinting. Plant Physiology. 130 (4), 1754-1754 (2002).
- Obel, N. Microanalysis of plant cell wall polysaccharides. Molecular Plant. 2 (5), 922-922 (2009).
- Mouille, G. Quantitative trait loci analysis of primary cell wall composition in Arabidopsis. Plant Physiology. 141 (3), 1035-1035 (2006).
- Bauer, S. Development and application of a suite of polysaccharide-degrading enzymes for analyzing plant cell walls. PNAS. 103 (30), 11417-11417 (2006).
- Pauly, M. A xyloglucan-specific endo-beta-1,4-glucanase from Aspergillus aculeatus: expression cloning in yeast, purification and characterization of the recombinant enzyme. Glycobiology. 9 (1), 93-93 (1999).
- Aboughe-Angone, S. Cell wall carbohydrates from fruit pulp of Argania spinosa: structural analysis of pectin and xyloglucan polysaccharides. Carbohydr Res. 343 (1), 67-67 (2008).
- Brown, D. M. Comparison of five xylan synthesis mutants reveals new insight into the mechanisms of xylan synthesis. Plant Journal. 52 (6), 1154-1154 (2007).
- Lee, C. The PARVUS gene is expressed in cells undergoing secondary wall thickening and is essential for glucuronoxylan biosynthesis. Plant Cell Physiol. 48 (12), 1659-1659 (2007).
- Obel, N. Pectin may hinder the unfolding of xyloglucan chains during cell deformation: implications of the mechanical performance of Arabidopsis hypocotyls with pectin alterations. Molecular Plant . , (2009).
- Cavalier, D. M., Keegstra, K. Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).
- Leonard, R. Identification of an Arabidopsis gene encoding a GH95 alpha1,2-fucosidase active on xyloglucan oligo- and polysaccharides. Phytochemistry. 69 (10), 1983-1983 (2008).
- Cavalier, D. M., Keegstra, K. Two xyloglucan xylosyltransferases catalyze the addition of multiple xylosyl residues to cellohexaose. Journal of Biological Chemistry. 281 (45), 34197-34197 (2006).
- Lee, C. H. The irregular xylem9 mutant is deficient in xylan xylosyltransferase activity. Plant and Cell Physiology. 48 (11), 1624-1624 (2007).
- Iglesias, N. Apoplastic glycosidases active against xyloglucan oligosaccharides of Arabidopsis thaliana. Plant and Cell Physiology. 47 (1), 55-55 (2006).
- Fujino, T., Sone, Y., Mitsuishi, Y., Itoh, T. Characterization of cross-links between cellulose microfibrils, and their occurrence during elongation growth in pea epicotyl. Plant Cell Physiol. 41 (4), 486-486 (2000).
- Vanzin, G. F. The mur2 mutant of Arabidopsis thaliana lacks fucosylated xyloglucan because of a lesion in fucosyltransferase AtFUT1. PNAS. 99 (5), 3340-3340 (2002).
- Cavalier, D. M. Disrupting two Arabidopsis thaliana xylosyltransferase genes results in plants deficient in xyloglucan, a major primary cell wall component. Plant Cell. 20 (6), 1519-1519 (2008).
- Hilz, H. A comparison of liquid chromatography, capillary electrophoresis, and mass spectrometry methods to determine xyloglucan structures in black currants. Journal of Chromatography A. 1133 (1-2), 275-275 (2006).
- Pauly, M. Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells. Planta. 214 (1), 67-67 (2001).
