قياس نشاط خلايا في Calpain الثابتة والعيش من خلال التدفق الخلوي

Summary

هذه المادة سوف بالتفصيل بروتوكول لقياس النشاط calpain في الخلايا الحية باستخدام الثابتة والتدفق الخلوي.

Abstract

Calpains موجودة في كل مكان داخل الخلايا ، والكالسيوم الحساسة ، البروتياز السيستين محايدة

Protocol

إعداد الكواشف

ملاحظة : جميع PBS يحتوي الكالسيوم والمغنيسيوم ^{2 + 2 +}

1. كشف الكاشف
   إضافة 20μM - 7 - 4 - الأمينية كلوروميثيل الكومارين ، تي BOC - يسين ، ميثيونين أميد (BOC - LM - تواجه المركز) إلى درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني. وسوف تتطلب كل خلية تعليق 2mL كاشف الكشف.
2. 1 ٪ لامتصاص العرق (خلايا ثابت)
   تمييع 4 ٪ محلول المخزون بارافورمالدهيد في درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني. بارافورمالدهيد قسامة 1mL 1 ٪ لكل أنبوب FACS. هناك حاجة إلى ثلاث أنابيب FACS لكل شرط التجريبية (مثلا 32Dkit ، 32Dkit PD150606 + ، + 32Dkit PD98059 حاجة 9 FACS أنابيب)
3. PD150606 (calpain المانع)
   إعادة PD150606 في DMSO إلى التركيز النهائي لل100mM. حماية هذا الكاشف وجميع الخلايا المعالجة معها بعيدا عن الضوء لمدة من هذه التجربة.
4. PD98059 (MEK1 المانع)
   إعادة PD98059 في DMSO إلى التركيز النهائي لل50mM.

تحضير خلايا

1. تنمو الخلايا في 32Dkit 5 × ⁰⁵ حتي 01 أكتوبر × 10 ⁶ خلية لكل مليلتر في OPTI - MEM الإعلام تستكمل مع مصل بقري جنيني من 5 ٪ ، WEHI - 3 طاف كمصدر للIL - 3 (أو أي مصدر آخر لمثل هذه IL - 3 كما البروتين المؤتلف) ، 0.1 ٪ 2 - المركابتويثانول والمضادات الحيوية.
2. جمع 12 × 10 ⁶ خلايا 32Dkit في أنابيب فالكون three 15mL (4 × 10 ⁶ خلايا في أنبوب).
3. بيليه الخلايا في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق عند 15 درجة مئوية.
4. نضح لطاف. Resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني 2mL غرفة درجة الحرارة.
5. معاملة بعضهم مع التعليق الخلية 50μM PD150606. ضمان حماية العينة من الضوء من خلال تغطية أنبوب فالكون بورق الألمنيوم. دوامة لفترة وجيزة ثم احتضان لمدة عشرين إلى ثلاثين دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
6. علاج تعليق الخلية الثانية مع 20μM PD98059. لوحة الخلايا في نسيج الثقافة طبق 35mm واحتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.

Calpain الفحص في خلايا الثابتة

1. في حين أن العينات مع PD150606 يحتضنها ، والشروع في مقايسة calpain على عينات غير المعالجة. تبدأ بإضافة 2mL كاشف الكشف لتعليق كل خلية. إضافة 1mL الفور للتعليق خلية / الكشف عن خليط كاشف للأنابيب FACS معدة مسبقا مع بارافورمالدهيد 1 ٪ (0 نقطة زمنية دقيقة).
2. احتضان الايقاف الخلية مع كاشف الكشف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم يضاف 1mL لتعليق الخلية إلى أنبوب FACS مع 1mL بارافورمالدهيد 1 ٪.
3. مواصلة احتضان الايقاف الخلية مع خليط الكشف لمدة 5 دقائق إضافية في درجة حرارة الغرفة. ثم يضاف 1mL لتعليق الخلية إلى أنبوب FACS مع 1mL بارافورمالدهيد 1 ٪.
4. تكرار الفحص calpain على الخلايا 32Dkit التي تم التعامل مع مثبطات.
5. إصلاح الخلايا في الظلام بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
6. بيليه اليوم التالي الخلايا في 1800 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق عند 15 درجة مئوية.
7. نضح لطاف. Resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني 750uL. مكان الخلايا والحفاظ على الجليد في الظلام.

الحصول على بيانات عن خلايا الثابتة

1. تحليل الخلايا باستخدام الثاني LSR دينار بحريني (العلوم البيولوجية). يتم تعيين المرشحات لXcyte الخفيفه (UV) ليزر ، 355nm خط الإثارة والقوة 25mW الليزر ، والانبعاثات من 405 و 450 نانومتر لالركيزة والمنتج على التوالي. مرشحات تمرير الفرقة لتكون الركيزة والمنتج و405/20 450/50. مرشحات تمريرة طويلة للمنتج هي الركيزة و405 و 450. تم تعيين PMT على الجهد 350-375 325-350 عن الركيزة وللمنتج.
2. انشاء تجربة FACSDiva دينار بحريني مع المعلمات التالية : مبعثر إلى الأمام ؛ مبعثر الجانب ؛ الهندية - 1 أزرق (سجل) ؛ الهندية - 1 فيوليت (سجل). في ورقة العمل إعداد الرسوم البيانية التالية : مبعثر إلى الأمام مقابل مؤامرة مبعثر مع الجانب نقطة بوابة على الخلايا الحية (الشكل 1A) ، الهندية - 1 المدرج الأزرق ، الهندو الرسم البياني 1 بنفسجي ، أزرق الهندية - 1 - 1 مقابل الهندية فيوليت نقطة المؤامرة.
3. معايرة الثاني LSR مع AlignFlow AlignFlow زائد والخرز فلوري (Invitrogen). ينبغي تعديل PMT الجهد لوضع الرسم البياني لذروة التألق حبة في نفس القناة قبل كل تجربة.
4. ستبدأ بالحصول على البيانات باستخدام الخلايا 32Dkit عند النقطة الدقيقة الوقت 0. ضبط الفولتية المعلمة حسب الضرورة. الحصول على وتسجيل 10000 الأحداث في العينة.
5. تكرار للاستحواذ على كل عينة ، الشطف الجهاز مع نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة بين كل أنبوب.
6. تصدير البيانات. يتم تنظيف ضمان LSR الثاني وفقا لمبادئ توجيهية المعهد.

Calpain الفحص في الخلايا الحية

1. إعداد تعليق الخلية على النحو الوارد أعلاه ، مع عدم وجود PD150606. إحضار عينات الى الثاني LSR واقامة المصافي والمعلمات على النحو الوارد أعلاه. إعداد ورقة العمل على النحو الوارد أعلاه. وتشمل مؤامرة كبيرة تظهر نقطة الهندية - 1 الأزرق مقابل الوقت. وضع برنامج للحصول على الحد الأقصى لعدد الأسطواناتنوفمبر من الأحداث (أي بوابة إيقاف).
2. إضافة تعليق 50μM PD150606 خلية واحدة من الخلايا 32Dkit. الحفاظ على عينة في الظلام واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة.
3. ستبدأ بالحصول على بيانات عن التعليق الخلية 32Dkit مع عدم وجود PD150606. استخدام معدل تدفق منخفض من 200-300 الأحداث في الثانية الواحدة. بعد 30 ثانية إلى 1 دقيقة إزالة أنبوب من الجهاز. إضافة 20μM BOC - LM - تواجه المركز للخلايا. دوامة لفترة وجيزة ثم مواصلة الحصول على البيانات.
4. الحصول على البيانات لمدة 10-20 دقيقة أو حتى الهضاب calpain النشاط.
5. كرر الخطوات من 3 و 4 مع الخلايا 32Dkit تعامل مع PD150606.
6. تصدير البيانات. يتم تنظيف ضمان LSR الثاني وفقا لمبادئ توجيهية المعهد.

Calpain الفحص بالسكان في مجمع الخلية (مختلط)

* وهذه التجربة في تحديد الخلايا 32Dkit تعليق الخلية التي تحصد من الطحال الماوس.

1. الحصاد والطحال من كل الماوس. ليز وخلايا الدم الحمراء مع الكلورين NH ₄ لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
2. إعداد تعليق خلية واحدة في برنامج تلفزيوني 2mL.
3. تقسيم كل خلية في تعليق اثنين. 1 تعليق علاج الخلية مع 50μM PD150606 لمدة 20-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
4. المضي قدما على النحو الوارد أعلاه لCalpain الفحص في خلايا الثابتة (الخطوات 1-6)
5. نضح لطاف. غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني 500μL. نضح لطاف.
6. Resuspend الخلايا في تلطيخ 200μL العازلة مع جيش صرب البوسنة 2 ٪. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
7. إعداد الأجسام المضادة الأولية (FITC مكافحة CD117 الماوس). ينبغي أن تستخدم الأجسام المضادة في التخفيف 1:200 في تلطيخ العازلة. ضمان أن يظل الأضداد في الظلام.
8. إضافة الضد 200μL الأولية إلى الخلايا. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
9. إضافة إلى 400μL PBS لزيادة حجم التدفق الخلوي. مكان الخلايا والحفاظ على الجليد في الظلام.
10. المضي قدما كما هو موضح في الحصول على بيانات عن الخلايا الثابتة. إضافة إلى FITC المعلمات وتشمل الرسم البياني للFITC على ورقة العمل.

تحليل النتائج والممثل

1. تحليل البيانات باستخدام FlowJo (Treestar). بوابة على الخلايا الحية على أساس التعريف مبعثر إلى الأمام والجانب (الشكل 1A). تحديد مضان يعني الهندية للأزرق من بوابة خلية قابلة للحياة (1B الشكل).
2. أ) بالنسبة للسكان الخلية المختلطة
   • استخدام FITC مضان على رسوم بيانية ومخططات لتحديد نقطة السكان 32Dkit
   • تحديد مضان يعني الهندية للأزرق من السكان 32Dkit
3. استخدام Microsoft Excel إلى الرسم البياني في مضان يعني (الشكل 2A). حساب المنحدر من الخط الفاصل بين 5 و 10 دقيقة. الرسم البياني المنحدر كما رسم بياني شريطي لتحديد النشاط calpain في الخلايا (الشكل 2B).

الشكل 1A. تحديد الخلايا الحية على أساس التعريف مبعثر إلى الأمام والجانب.

1B الرقم. مضان متوسط ​​التغير على مدى 10 دقيقة دوام.

الشكل 2A. الممثل يعني الرسم البياني لمضان.

الرقم 2B النشاط Calpain. 32Dkit في الخلايا مع مثبطات.

Discussion

وقد تم تحديد النشاط في الخلايا calpain 32Dkit الثابتة والذين يعيشون في هذا البروتوكول الفيديو. أدت المعاملة من خط الخلية مع مثبط calpain PD150606 في تثبيط كامل للنشاط calpain في الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، أدت المعاملة مع مثبط MEK1 PD98059 في تثبيط كامل للنشاط calpain في الخلايا. إرك هو المنشط الرئيسي لcalpain - 2 ^3. هذه النتائج تشير إلى أن calpain - 2 النشاط هو السائد في الخلايا 32Dkit. العمل الحالي في مختبرنا تحقق من عواقب زيادة النشاط calpain ومساهمات calpain - 1 و 2 في calpain اللوكيميا.

ويمكن استخدام هذه التفاصيل بروتوكول تدفق cytometric first مقايسة تستند إلى قياس مستويات النشاط calpain في الخلايا الحية والثابتة ولفهم آلية التنظيم calpain ودورها في العمليات المرضية باستخدام خلايا سليمة.

يمكن تعديل هذا البروتوكول لدراسة الآثار المترتبة على مثبطات أو التلاعب الجيني على النشاط calpain. بالإضافة ، يمكن استخدام هذا الاختبار لقياس النشاط calpain في خليط معقد من الخلايا مثل دم الحبل السري أو لتحديد وقياس نشاط calpain فرعية في زنزانة انفرادية من الطحال.

هذا الاختبار لا يميز بين النشاط الناتجة عن مختلف الأشكال الإسوية calpain. ويمكن استخدام الكواشف الجينية أو الدوائية أن نهدم أو تمنع calpains محددة لمعالجة هذه المسألة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde	Invitrogen		Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C
PD150606	Invitrogen		Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition.
PD98059	Cell Signaling Technology
AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes	Invitrogen
LSR II	BD Biosciences		Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth.