在固定和活细胞，流式细胞仪测量钙蛋白酶活性

Summary

本文将详细测量固定和生活用流式细胞仪检测细胞中的蛋白酶活动的协议。

Abstract

钙蛋白酶是无处不在的细胞内钙敏感，中性半胱氨酸蛋白酶

Protocol

准备试剂

注：所有PBS含有的Ca ^{2 +}和Mg ^{2 +}

1. 检测试剂
   20μM7 - 氨基-4 - 氯甲基香豆素，T - BOC -亮氨酸，蛋氨酸酰胺（BOC - LM - CMAC）添加至室温，PBS。每个细胞悬液，将需要2ML的检测试剂。
2. 1％多聚甲醛（定格）
   稀4％多聚甲醛在室温PBS原液。每个流式细胞仪管分装1ml含1％多聚甲醛。流式细胞仪三管为每个实验条件的要求（如32Dkit，32Dkit + PD150606，32Dkit + PD98059需要9流式细胞仪管）
3. PD150606（蛋白酶抑制剂）
   重组在DMSO PD150606到终浓度为100mm。保护此试剂和所有与本实验的持续时间从光线处理的细胞。
4. PD98059（MEK1抑制剂）
   重组在DMSO终浓度的PD98059为50mm。

准备细胞

1. × 10 ⁵至1 × 10 ⁶细胞每毫升OPTI - MEM媒体与5％胎牛血清，WEHI - 3上清液作为源（或任何其他来源的IL - 3，IL - 3补充，增长5 32Dkit细胞作为重组蛋白），0.1％，2 - 巯基乙醇和抗生素。
2. 收集到三个15ML猎鹰的管（4 × ¹⁰ 6细胞每管）12 × ¹⁰ 6 32Dkit的细胞。
3. 5分钟沉淀细胞在1000 rpm，在15 ° C。
4. 吸出上清液。 2ML房间温度PBS重悬细胞。
5. 治疗50μMPD150606细胞悬液。确保样本覆盖猎鹰管铝箔避光。涡孵育一段时间后二十到三十分钟，在室温下在黑暗中。
6. 治疗20μM的PD98059的第二个细胞悬液。板在一个35mm的组织培养皿中孵化，并为2个小时的细胞在37 ° C。

在固定细胞的钙蛋白酶含量

1. 虽然样本PD150606孵化，开始对未经处理的样品的蛋白酶检测。从每个细胞悬液加入2ML检测试剂开始。立即加入1ml到先前准备的流式细胞仪管的细胞悬液/检测试剂混合，用1％多聚甲醛（0分钟的时间点）。
2. 与检测试剂为5分钟，在室温下孵育细胞悬液。然后加入细胞悬液1ml到一个流式细胞仪管，用1ml 1％多聚甲醛。
3. 继续孵育检测混合细胞悬浮液在室温下额外的5分钟。然后加入细胞悬液1ml到一个流式细胞仪管，用1ml 1％多聚甲醛。
4. 重复32Dkit已与抑制剂治疗的细胞蛋白酶检测。
5. 修复细胞在黑暗中过夜，在4 ° C。
6. 第二天沉淀在5分钟1800转的细胞在15 ° C。
7. 吸出上清液。在750uL PBS重悬细胞。置于冰上的细胞，并保持在黑暗中。

固定细胞获取数据

1. 分析使用一个LSR II（BD生物科学）的细胞。过滤器设置的光波Xcyte（UV）激光，激发线355纳米和激光功率25MW，底物和产物分别为405和450 nm的排放。底物和产物的带通滤波器二十○分之四百〇五和五十分之四百五十零。为底物和产物的长传过滤器405和450。 PMT电压设定在350-375和325-350为底物的产品。
2. 设置一个BD FACSDiva带有以下参数的实验：前向散射;侧散射;印支1蓝（日志）;印支1紫（日志）。在工作​​表上设置了以下图表：前向散射对侧向散射对活细胞的门（图1a），​​印度支那1，印度，印支1紫罗兰直方图1蓝与印支1紫蓝色直方图散点图点图。
3. 校准与AlignFlow和AlignFlow LSR II PLUS（Invitrogen）的荧光珠。光电倍增管电压应调整放置在每次实验前，相同的信道珠荧光直方图的高峰期。
4. 使用32Dkit细胞在0分钟的时间点开始采集数据。调整必要的参数电压。获取和记录10000个样本事件。
5. 每个样品重复采集，每管之间的流式细胞仪的缓冲区冲洗机。
6. 导出的数据。确保LSR II是根据研究所的指引清洗。

在活细胞中的钙蛋白酶含量

1. 上述制备细胞悬液，没有PD150606。的LSR II带来的样品，并设置过滤器和参数。成立上述工作表。包括一个大型的散点图显示印支1蓝与时间。设置方案，以获得最大的NUM事件的BER（没有停止门）。
2. 添加50μMPD150606一个32Dkit细胞的细胞悬液。在黑暗中保持样品在室温下孵育20-30分钟。
3. 开始获取32Dkit细胞悬液没有PD150606数据。使用低流速每秒200-300事件。 30秒到1分钟后，从机器中取出管。 20μMBOC - LM - CMAC的细胞。涡简要然后继续采集数据。
4. 10-20分钟，或直至蛋白酶活性高原获取数据。
5. 与PD150606治疗的32Dkit细胞，重复步骤3和4。
6. 导出的数据。确保LSR II是根据研究所的指引清洗。

钙蛋白酶含量的复合（混）的细胞群

*本实验将确定32Dkit收获了从小鼠脾细胞悬液细胞。

1. 收获从每个鼠标的脾脏。裂解红细胞与NH ₄氯在室温下10分钟。
2. 准备在2ML PBS单细胞悬液。
3. 一分为二的每一个细胞悬液。治疗50μMPD150606 1细胞悬液，在室温下在黑暗中为20-30分钟。
4. 按照上述固定细胞中的钙蛋白酶含量（步骤1-6）
5. 吸出上清液。在500μLPBS清洗细胞。吸出上清液。
6. 2％BSA的细胞重悬于200μL染色缓冲。 15分钟在室温下孵育。
7. 准备的主要抗体（FITC标记的抗小鼠CD117）。应使用该抗体染色缓冲液在1:200稀释。确保抗体是被蒙在鼓里。
8. 加入200μL第一抗体的细胞。孵育30分钟，在室温下在黑暗中。
9. 添加400μLPBS增加流式细胞仪的体积。置于冰上的细胞，并保持在黑暗中。
10. 按照固定细胞获取数据。加入FITC标记的参数，包括为FITC标记的工作表上的直方图。

分析和代表性的结果

1. 使用FlowJo（Treestar）分析数据。门上的活细胞的基础上正向和侧向散射剖面（图1a）。确定印度蓝门（图1b）从活细胞的平均荧光。
2. 一）为混合细胞群
   • 使用柱状图和点图FITC荧光识别32Dkit人口
   • 印度蓝确定的32Dkit人口平均荧光
3. 使用Microsoft Excel图表的平均荧光（图2a）。计算之间的5分钟和10分钟线的斜率。图的斜率为条形图，以确定细胞中的蛋白酶活性（图2b）。

图1a确定前部和侧散射轮廓为基础的活细胞。

图1b。平均超过10分钟的时间当然的荧光变化。

图2a。代表图的平均荧光。

图2b。钙蛋白酶活性抑制剂的32Dkit细胞。

Discussion

在固定和生活32Dkit细胞的钙蛋白酶活动已确定在这个视频协议。导致完全抑制蛋白酶的活性，在细胞治疗的细胞株的蛋白酶抑制剂PD150606。此外，治疗与MEK1抑制剂PD98059完全抑制蛋白酶的活性，在细胞内。 ERK的是主要激活的钙蛋白酶2 ^3。这些结果表明，钙蛋白酶2的活动主要是在32Dkit细胞。在我们的实验室目前的工作是调查蛋白酶的活性增加造成的后果和蛋白酶- 1 - 2蛋白酶在白血病的贡献。

该协议的细节第一个基于流式细胞仪的检测，以测量固定和活细胞中的蛋白酶活性水平，并可以用来了解蛋白酶调节和使用完整细胞的病理过程中的作用机制。

这个协议可以进行修改，以检查蛋白酶活性抑制剂或基因操作的影响。此外，这种检测可以用来测量细胞的脐带血或确认和计量蛋白酶从脾脏中分离的细胞亚群的活动，如在一个复杂的混合的钙蛋白酶活性。

本分析不区分不同的异构体的蛋白酶产生的活动。击倒或抑制特定的钙蛋白酶的基因或药物试剂，可以用来解决这个问题。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde	Invitrogen		Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C
PD150606	Invitrogen		Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition.
PD98059	Cell Signaling Technology
AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes	Invitrogen
LSR II	BD Biosciences		Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth.