Summary
Kwantificering van DNA dubbelstrengs breuken aan de hand van γH2AX foci is uitgegroeid tot een instrument van onschatbare waarde, met name in de biologie straling, voor de evaluatie van weefsel stralingsgevoeligheid en de effecten van de straling wijzigen van verbindingen. Hier laten we zien het gebruik van een immunofluorescentie test voor kwantificatie van γH2AX foci in weefselmonsters.
Abstract
DNA dubbel-breuken (DSB's) zijn bijzonder dodelijk en genotoxische letsels, die kan ontstaan door endogene (fysiologische of pathologische) processen of door exogene factoren, met name ioniserende straling en radiomimetische verbindingen. Fosforylatie van de H2A histon-variant, H2AX, op de serine-139 residu, in de zeer geconserveerd C-terminale SQEY motief, de vorming van γH2AX, is een vroege reactie op DNA-dubbel-breuken
Protocol
Tissues
- Longweefsel, ingebed in mallen in optimale snij-temperatuur (LGO) verbinding 4583, werd doorsnede (5 micrometer) met behulp van een CM Leica 1950 cryostaat en gemonteerd op poly-L-lysine dia's.
De bevroren monsters werden verkregen van dr. Simon Royce aan de Murdoch Children's Research Institute. Longweefsel werd verkregen van onbehandelde Balb / c muizen en van een muismodel van chronische allergische luchtwegaandoeningen die veel van de pathologische kenmerken van de menselijke astma zes shows. Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Animal Ethische Commissie van Onderzoek van de Murdoch Children's Institute, die voldoet aan de Australische Code of Practice voor de verzorging en het gebruik van proefdieren voor wetenschappelijke doeleinden in te stellen.
- Secties werden toegestaan om droge lucht bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
Immunofluorescentiekleuring
- Secties werden gefixeerd met 2% (w / v) paraformaldehyde in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 20 minuten.
- Secties werden geëquilibreerd met twee wasbeurten in PBS gedurende 15 minuten elk.
- Secties werden behandeld met 70% ethanol (gekoeld tot -20 ° C) gedurende 20 minuten gevolgd door drie wasbeurten in PBS gedurende 10 minuten elk.
Op dit punt dia's kunnen worden opgeslagen in verzegelde containers bij 4 ° C gedurende maximaal twee weken.
- Secties werden drie keer gewassen met PBS gedurende 10 minuten per stuk en vervolgens geblokkeerd met 100μL vers bereid in PBS met 8% BSA in PBS met 0,5% Tween-20 en 0,1% Triton X-100 (PBS-TT) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur .
Alle incubaties werden uitgevoerd in een bevochtigde vlekken trog. - Secties werden gewassen met PBS-TT voor 5 minuten en een hydrofobe omtrek stond in het teken rond het weefsel met een Pap pen.
- Excess buffer werd getipt en 100μl van primaire konijn polyklonaal anti-γH2AX antilichaam (1:500 verdund in 1% BSA in PBS, Millipore), werd toegevoegd aan elke sectie voor een 2 uur incubatie bij kamertemperatuur.
Incubatie met de primaire antilichaam kan 's nachts worden uitgevoerd bij 4 ° C.
Voor verder bewijs, dat γH2AX brandpunten vertegenwoordigen DSB's, kan een primaire antilichaam dat een DSB reparatie eiwit ook worden gebruikt. Bijvoorbeeld, co-lokalisatie van γH2AX en fosfo-ATM is een veel gebruikte combinatie. - Secties werden twee keer gewassen in PBS-TT voor 5 minuten en geïncubeerd met 100μl van secundaire antilichaam (Alexa Fluor 488 geit anti-konijn IgG verdund 1:500, in 1% BSA, Invitrogen) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker . (Verwaterd antilichaam werd in het donker bewaard gedurende de procedure).
- Secties werden drie keer gewassen met PBS-TT voor 5 minuten en geïncubeerd met 0.5mg/mL RNAse A gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Nucleaire tegenkleuring en montage werd uitgevoerd met Vectashield medium dat propidiumjodide.
- De dia's werden verzegeld met nagellak en 's nachts bewaard bij 4 ° C in het donker voor de analyse.
Microscopie / Analyse
- Een Zeiss LSM510 Meta confocale microscoop werd gebruikt om beelden met behulp van de standaard GFP te verwerven (voor γH2AX - Alexa Fluor 488 geit anti-konijn IgG) en PI (543 nm) lasers.
Beelden werden verworven in een Z-serie patroon met een stapgrootte van 0,5 micrometer. Tijdens de analyse werden de individuele vliegtuigen deconvoluted en gestapeld tot een maximum geprojecteerde beeld te produceren om de overlap van de brandpunten te minimaliseren.
De methode van het creëren van een maximaal geprojecteerde beeld voorafgaand aan een deeltje tellen mag alleen worden gebruikt in omstandigheden waarin een dunne sectie (bv 5 urn) wordt gebruikt en waar de achtergrondkleuring is te verwaarlozen. Waar dikkere secties met een belangrijke achtergrond moet worden onderzocht, moet een meer complexe analyse, zoals 3D-object Counter zoals beschreven door Bolte en Cordelières (2006) worden gebruikt 7.
- Metamorph (Molecular Devices, USA) werd gebruikt om samengevoegd (rood en groen) beelden te creëren om nummers van de foci kwantificeren.
Hoewel Metamorph kunnen worden gebruikt om brandpunten nummers kwantificeren, meestal bij het gebruik van weefsel foci worden handmatig geteld (door oog) voor een grotere nauwkeurigheid.
Specifieke celtypen van belang kunnen geselecteerd worden voor kwantificatie, bijvoorbeeld longepitheelcellen. Dit kan worden gedaan op basis van histologie en onder verwijzing naar haematoxyline en eosine gekleurde seriële secties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor de toepassing van deze demonstratie we muis longweefsel gebruikt van onbehandelde Balb / c muizen en van een muismodel van chronische allergische luchtwegaandoeningen. We gekwantificeerd verschillen in het aantal foci per cel met een iets hogere gemiddelden waargenomen in de beschadigde longen in vergelijking met onbehandelde delen. In het bijzonder, kwantificatie aangegeven 6,5 foci per / cel en 9,4 foci per / cel (handmatige telling van 20 cellen per sectie), in het onbehandelde weefsel en chronische allergische luchtwegaandoeningen weefsel, respectievelijk. Echter, zou het gebruik van een DSB-inducerende middel, bijvoorbeeld naftaleen, waarvan bekend is dat DSB's te induceren in de muis long-model, opbrengst hoger foci nummers. Inderdaad, dit protocol is het meest geschikt is voor het onderzoek naar de effecten van ioniserende straling in de weefsels, meer opvallende resultaten, in termen van γH2AX foci nummers en resolutie worden verkregen wanneer ioniserende straling wordt gebruikt. Het is bekend dat na blootstelling aan X-stralen, γH2AX foci form snel en foci nummers een maximaal bereik tussen de 30-60 minuten 2. Daarom, een uur tijdstippen (post-bestraling) zijn ideaal voor het evalueren van de initiële vorming en DSB langere tijd (meestal tot 48 uur) kan worden gebruikt om DNA te repareren controleren.
Over het geheel genomen kwantificatie van γH2AX in weefsels is nuttig voor monitoring DSB vorming en reparatie. Afgezien van het nut ervan in de context van ioniserende straling, kan de methode worden toegepast op de evaluatie van de werkzaamheid van DSB-inducerende verbindingen in verschillende weefsels, bijvoorbeeld de veel gebruikte antikanker anthracyclines zoals doxorubicine is bekend dat DSB's veroorzaken, en mogelijk te controleren verschillende pathologieën die gekenmerkt worden door reactive oxygen species-gemedieerde DSB's. Belangrijk is dat dit protocol is geschikt voor verschillende muis weefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De steun van het Australian Institute of Nuclear Science and Engineering wordt erkend. TCK was de ontvanger van AINSE awards. Epigenomisch Medicine Lab wordt ondersteund door de National Health en Medical Research Council van Australië (566.559). LM wordt ondersteund door Melbourne Research (Universiteit van Melbourne) en Biomedical Imaging CRC aanvullende beurzen. De ondersteuning van Monash Micro Imaging (Drs Stephen Cody en Iska Carmichael) was van onschatbare waarde voor dit werk. MMT is dankbaar voor de deskundige hulp en advies van dr. Olga Sedelnikova van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Glaser | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, Millipore | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M.
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &, Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
