Summary
Количественный анализ ДНК двунитевых разрывов на основе γH2AX очагов стал бесценным инструментом, особенно в области радиационной биологии, для оценки радиочувствительности тканей и воздействию радиации изменения соединений. Здесь мы демонстрируем использование иммунофлуоресценции для количественного определения γH2AX очагов в образцах тканей.
Abstract
ДНК двунитевых разрывов (ДР) особенно смертоносным и генотоксического повреждения, которые могут возникнуть либо эндогенного (физиологического или патологического) процессов или экзогенных факторов, в частности, ионизирующего излучения и радиомиметическое вещество соединений. Фосфорилирование H2A гистонов вариант, H2AX, на серин-139 остатка, в хорошо сохранились и С-концевой мотив SQEY, образуя γH2AX, является ранний ответ на ДНК двунитевых разрывов
Protocol
Ткани
- Легкие ткани, встроенные в формы в оптимальной температуры резания (октябрь) 4583 соединения, была разделена (5 мкм) с помощью CM Leica 1950 криостата и установлен на поли-L-лизин слайдов.
Замороженные образцы были получены от д-р Саймон Royce на научно-исследовательского института Мердока детей. Легкие ткани была получена из необработанного Balb / с мышами и с мышиной модели хронические аллергические заболевания дыхательных путей, который показывает многие из патологических особенностей человеческого астмы 6. Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Комитетом животных Этика научно-исследовательского института Мердока детей, которая придерживается австралийский Кодекс практики по уходу и использованию лабораторных животных для научных целей.
- Разделы было позволено высохнуть на воздухе при комнатной температуре в течение 1 часа.
Иммунофлуоресценции окрашивание
- Разделы были зафиксированы с 2% (м / о) параформальдегид в фосфатном буферном растворе (PBS) в течение 20 минут.
- Срезы уравновешенной с двумя моется в PBS в течение 15 минут каждый.
- Срезы обрабатывают 70% этанола (охлажденной до -20 ° С) в течение 20 минут, затем три моет в PBS в течение 10 минут каждый.
На данный момент слайды могут храниться в плотно закрытых емкостях при температуре 4 ° С в течение 2 недель.
- Срезы трижды промывали PBS в течение 10 минут каждый, а затем заблокировали с 100 мкл свежеприготовленного в PBS, содержащий 8% BSA в PBS, содержащем 0,5% Твин-20 и 0,1% Тритон Х-100 (PBS-ТТ) в течение 1 часа при комнатной температуре .
Все инкубации проводили в увлажненной корыта окрашивания. - Разделы промывали PBS-TT в течение 5 минут и гидрофобных периметру был отмечен вокруг ткани с Пап пера.
- Превышение буфер наклонили и 100 мкл первичных кролик поликлональных анти-γH2AX антител (разбавленной 1:500, в 1% БСА в ФСБ; Millipore), был добавлен в каждом разделе 2 часа инкубации при комнатной температуре.
Инкубация с первичными антителами может быть выполнена в течение ночи при 4 ° C.
Для дальнейшего доказательства, что γH2AX очаги представляют ДР, первичное антитело признании белка DSB ремонта могут быть также использованы. Например, совместно локализации γH2AX и фосфорно-банкомат обычно используется комбинация. - Разделы промывали два раза PBS-TT в течение 5 минут каждая, и инкубируют с 100 мкл вторичных антител (Alexa Fluor 488 козьего анти-IgG кролика разбавленной 1:500, в 1% BSA; Invitrogen) в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте . (Разводненная антител был в неведении в течение всей процедуры).
- Срезы трижды промывали PBS-TT в течение 5 минут каждый, и инкубировали с 0.5mg/mL РНКазы в течение 30 минут при температуре 37 ° C.
- Ядерная counterstaining и монтаж был выполнен с Vectashield среде, содержащей пропидий йодида.
- Слайды были опечатаны с лаком для ногтей и храниться в течение ночи при 4 ° С в темноте перед проведением анализа.
Микроскопия / Анализ
- Мета Zeiss LSM510 конфокальной микроскопии был использован для приобретения изображений с помощью стандартного GFP (для γH2AX - Alexa Fluor 488 козьего анти-IgG кролика) и PI (543 нм) лазеры.
Изображения были приобретены в Z-серии модель с шагом в 0,5 мкм. При анализе отдельных самолетов deconvoluted и сложены для получения максимальной проецируемого изображения, чтобы минимизировать перекрытие очагов.
Метод создания максимально проецируемого изображения до количество частиц должно использоваться только в тех случаях, когда тонкий срез (например, 5 мкм) используется и где фоне окрашивание незначительно. Где толще разделов со значительным фон должен быть проанализирован, более сложного анализа, таких как 3D объект счетчика, как описано в Болте и Cordelieres (2006) должны быть использованы 7.
- Метаморф (Molecular Devices, США) была использована для создания объединенных (красный и зеленый) изображения для количественного определения количества очагов.
Хотя Метаморф может быть использована для количественного определения очагов номера, как правило, при использовании срезов ткани очагов подсчитываются вручную (на глаз) для большей точности.
Конкретные типы клеток интересов могут быть выбраны для количественного определения, например, легких эпителиальных клеток. Это может быть сделано на основе гистологических и со ссылкой на гематоксилин-эозином окрашенных серийных срезов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для этой демонстрации мы использовали ткани легких мышей из необработанных Balb / с мышами и с мышиной модели хронические аллергические заболевания дыхательных путей. Мы количественно различия в количестве очагов на клетку с несколько более высокие средние наблюдается в поврежденных легких по сравнению с необработанными разделов. В частности, количественный указанных очагов на 6,5 / 9,4 клетки и очаги в / элемент (ручной подсчет 20 ячеек в каждой секции), в необработанной ткани и хронические аллергические заболевания дыхательных путей, ткани, соответственно. Тем не менее, использование DSB-индуцирующих агентов, например, нафталин, который, как известно, вызывают ДР в модели легких мыши, даст большее число очагов. Действительно, этот протокол больше всего подходит для исследования воздействия ионизирующего излучения в тканях; более поразительные результаты, с точки зрения γH2AX номера очагов и разрешении получаются, когда ионизирующего излучения. Хорошо известно, что после воздействия рентгеновских лучей, γH2AX очагов форме быстро и очагов номера достигают максимума между 30-60 минут 2. Таким образом, 1 час моменты времени (после облучения) идеально подходят для оценки начального формирования DSB и более длительное время (как правило, до 48 часов) может быть использован для мониторинга репарации ДНК.
В целом, количественного определения γH2AX в тканях, используется для мониторинга DSB формирования и ремонта. Помимо своей полезности в контексте ионизирующего излучения, метод может быть применен к оценке эффективности DSB-индуцирующих веществ в различных тканях, например, широко используются противоопухолевые антрациклины, такие как доксорубицин как известно, вызывают ДР, и, возможно, для контроля различных патологий, которые характеризуются активных форм кислорода-опосредованной ДР. Важно отметить, что данный протокол подходит для различных тканей мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Поддержке австралийского Института ядерной науки и техники не будет подтверждено. TCK был удостоен AINSE наград. Эпигеномном Лаборатории медицины при поддержке национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (566 559). Л. М. поддерживается Мельбурне исследований (Университет Мельбурна) и биомедицинской визуализации стипендии CRC дополнительных. Поддержка Micro Монаш Imaging (доктора Стивена Коди и ISKA Кармайкл) был бесценен для этой работы. ММТ выражает благодарность за экспертную помощь и совет от д-р Ольга Седельникова из Национального института здоровья.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound 4583 | Tissue-Tek | 4583 | ||
| Superfrost Plus | Polysine slides | Menzel-Glaser | SF41296SP | Electrostatically attracts frozen tissue sections and reduces the need for additional coatings and adhesives. |
| Tween 20 | Reagent | Calbiochem | 655205 | Tween 20 (0.5%), is a detergent to permeabilise cells |
| Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Anti-phospho-γH2AX (rabbit polyclonal antibody) | Primary Antibody | Upstate, Millipore | 07-164 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen | A-11008 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
| Ethanol (70%) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | BSPEL316 | ||
| RNAse A | Reagent | Qiagen | 19101 | |
| Vectashield PI | Reagent | Vector Laboratories | H-1300 | A glycerol based mounting medium containing propidium iodide (a red nuclear stain).This medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. Note: DNA stain commonly used: 4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI). Can only be used with microscopes with the appropriate excitation laser. |
| Mini PAP Pen | Invitrogen | 008877 | ||
| Coverslips (22x50mm) | Menzel-Glaser | CS2250100 | ||
| Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
| Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | |||
| CM Leica 1950 Cryostat | Leica Microsystems | |||
| Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices |
References
- Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).
- Bonner, W. M.
- Dickey, J. S. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Bhogal, N. Late residual gamma-H2AX foci in murine skin are dose responsive and predict radiosensitivity in vivo. Radiat Res. 173 (1), 1-9 (2010).
- Redon, C. E., Dickey, J. S., Bonner, W. M., Sedelnikova, O. A. gamma-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Adv Space Res. 43 (8), 1171-1178 (2009).
- Locke, N. R., Royce, S. G., Wainewright, J. S., Samuel, C. S., Tang, M. L., L, M. Comparison of airway remodeling in acute, subacute, and chronic models of allergic airways disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 36 (5), 625-632 (2007).
- Bolte, S. &, Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
