Senza etichetta In situ di lignificazione in pareti delle cellule vegetali

Summary

Un metodo basato sulla microscopia confocale Raman è presentato che offre etichetta senza visualizzazione di lignina nelle pareti delle cellule vegetali e il confronto di lignificazione nei diversi tessuti, campioni o specie.

Abstract

Energetici crescenti esigenze in modo sicuro ed efficiente è una sfida pressante globale. Pertanto, la ricerca sulla produzione di biocarburanti che cerca di trovare soluzioni economiche e sostenibile è diventato un compito d'attualità e critica. Biomassa lignocellulosica è pronta a diventare la principale fonte di biomassa per la conversione in biocarburanti liquidi ^1-6. Tuttavia, la riluttanza di questi materiali vegetali della parete cellulare di degrado economico ed efficiente, rappresenta uno dei principali ostacoli per il loro uso nella produzione di biocarburanti e prodotti chimici ^4. In particolare, lignina, un complesso e irregolare poli-fenilpropanoide heteropolymer, diventa problematica la postraccolta decostruzione della biomassa lignocellulosica. Per esempio nella conversione della biomassa per biocarburanti, inibisce saccarificazione nei processi di produzione di zuccheri semplici per la fermentazione ^7. L'uso efficace di biomassa vegetale per uso industriale è infatti in gran parte dipende dalla misura in cui è lignificati la parete cellulare delle piante. La rimozione della lignina è un fattore limitante costoso e ⁸ e lignina è quindi diventata una selezione delle piante obiettivo chiave e l'ingegneria genetica per migliorare la conversione della parete cellulare.

Strumenti analitici che consentono la caratterizzazione accurata rapida lignificazione delle pareti delle cellule vegetali diventato sempre più importante per valutare un gran numero di popolazioni nidificanti. Procedure estrattive per l'isolamento dei componenti nativi come la lignina sono inevitabilmente distruttiva, portando chimici significativi e modifiche strutturali ^9-11. Chimici di analisi in situ metodi sono quindi strumenti preziosi per la caratterizzazione composizionale e strutturale dei materiali lignocellulosici. Microscopia Raman è una tecnica che si basa sullo scattering anelastico o Raman di luce monocromatica, come quella da un laser, in cui è in relazione lo spostamento in energia dei fotoni laser per le vibrazioni molecolari e presenta una intrinseca senza etichetta molecolare "impronta digitale" del campione . Microscopia Raman può permettersi misure non distruttive e relativamente poco costoso, con minima preparazione del campione, dando intuizioni composizione chimica e struttura molecolare in un vicino stato nativo. Imaging chimica da microscopia Raman confocale è stato precedentemente utilizzato per la visualizzazione della distribuzione spaziale di cellulosa e lignina nelle pareti cellulari del legno ^12-14. Sulla base di questi risultati precedenti, abbiamo recentemente adottato questo metodo per confrontare lignificazione di tipo selvatico e lignina-deficienti transgenici trichocarpa Populus (pioppo nero) fusto in legno ^15. Analizzando le bande Raman lignina ^16,17 nella regione spettrale tra 1.600 e 1.700 cm ^-1, intensità del segnale lignina e localizzazione sono state mappate in situ. Il nostro approccio visualizzati differenze nel contenuto di lignina, localizzazione e composizione chimica. Più di recente, abbiamo dimostrato l'imaging Raman di polimeri della parete cellulare in Arabidopsis thaliana con risoluzione laterale che è sub-micron ^18. Ecco, questo metodo si presenta offrendo la visualizzazione della lignina nelle pareti delle cellule vegetali e il confronto di lignificazione nei diversi tessuti, campioni o specie, senza macchie o etichettatura dei tessuti.

Protocol

1. Preparazione del campione

1. Montare il campione idratato pianta, ad esempio, legno di pioppo o staminali staminali Arabidopsis thaliana, nel microtomo.
2. Tagliare sezioni sottili (tipicamente 20 micron di spessore) dal tessuto nativo.
3. Trasferire la sezione d'impianto su un vetrino per microscopio.
4. Mettere a bagno la sezione centrale in D ₂ O e coprire con un vetrino di vetro, che viene sigillato sul vetrino da microscopio per prevenire l'evaporazione di D ₂ O. La sezione centrale è ora pronta per l'imaging o può essere conservato per uso futuro.

2. Campione di misura

1. Applicare l'olio di immersione con l'obiettivo microscopio e / o lo slittamento di copertura.
2. Posizionare e fissare il vetrino sul palco scansione piezoelettrico del microscopio, con il vetrino di fronte l'obiettivo microscopio.
3. Mostra il campione attraverso la polizza di copertura con un obiettivo ad alta apertura numerica immersione microscopio (100x, NA = 1,40) e individuare l'area campione di interesse.
4. Dopo aver spento tutte le altre fonti di luce di laboratorio e il microscopio, la posizione risolta microspectroscopic misurazioni sono effettuate concentrandosi banda filtrata monocromatica luce verde (λ = 532 nm) da un cw-laser sul campione con una potenza tipica di 10 a 30 mW ( vedi figura 1 per uno schema del setup). Autofluorescenza può verificarsi in alcuni campioni, che possono vietare le misure utili, in cui l'eccitazione caso con la luce laser a lunghezza d'onda può essere consigliabile.
5. Il back-luce diffusa in differita Stokes Raman è raccolto dall'obiettivo microscopio, passa attraverso uno specchio dicroico, un foro stenopeico, che funge da filtro spaziale nel setup confocale, e un filtro longpass, e si concentra nella fessura di una grata spettrometro, dove la radiazione viene dispersa e rilevata da una camera CCD raffreddata, dando uno spettro Raman. Uno spettro Raman di legno di pioppo è mostrato nella Figura 2, con bande lignina caratteristica nella regione spettrale tra 1.600 e 1.700 cm ^-1.
6. Chimica per l'imaging e la visualizzazione della distribuzione spaziale lignina, una mappa bidimensionale spettrale è acquisita da raster scansione del campione attraverso il fuoco del laser con la fase di scansione piezoelettrici e la registrazione di uno spettro Raman per ogni posizione campione. Mappe spettrali tridimensionale può essere generato da impilare mappe bidimensionali per i quali è stato intensificato il fuoco del laser consecutivamente lungo la direzione z.

3. Analisi dei dati

1. Per l'industria chimica e la visualizzazione di immagini lignina, i dati raccolti vengono analizzati con MATLAB (The MathWorks, versione 7.7). I dati sono disposti in un cubo tridimensionale iperspettrale, che si compone di due dimensioni spaziali e una terza dimensione per i segnali spettrali.
2. Per l'analisi lignina, la regione spettrale tra 1.550 e 1.700 cm ^-1 è considerata (vedi figura 2). La distribuzione spaziale della lignina è visualizzato integrando l'intensità da 1.550 a 1.700 cm ^-1 della linea di base corretta con spettri (vedi figura 3). In alternativa alla correzione al basale, della derivata seconda spettri possono essere calcolati e il secondo derivato picchi utilizzati per l'analisi.
3. Localizzazione lignina e della chimica, con particolare riguardo alla coniferaldehyde e frazioni di alcool coniferyl, può essere ulteriormente analizzata valutando l'area sotto dotati picchi gaussiana delle tre bande trovato tra 1.600 e 1.700 cm ^-1 (vedi riquadro di Figura 2 e Refs 15. - 17).
4. Normalizzazione intensità tra le diverse mappe spettrali viene eseguita utilizzando come riferimento l'altezza del picco della band estrinseca OD che si estende circa 2.500 cm ^-1 negli spettri lume media, che si ottengono da k-means classificazione di clustering. Questo è fondamentale e permette di confrontare le intensità di segnale lignina tra misure diverse, tessuti, campioni e di specie.

4. Rappresentante Risultati

Uno spettro Raman rappresentante di pioppo (Populus angustifolia) fusto in legno è illustrato nella figura 2. Bande lignina caratteristiche si trovano nella regione spettrale tra 1.600 e 1.700 cm ^-1. A titolo di esempio, la distribuzione spaziale della lignina in un legno di pioppo di sezione è presentato in Figura 3. Rispetto alla immagine visibile, morfologicamente distinte regioni della parete cellulare diventano chiaramente distinguibili a causa della diversa intensità di segnale lignina. Ad alta intensità di segnale lignina si osserva negli angoli delle cellule (CC) e, un po 'meno, nel mezzo lamelle composto (CML). Quantità inferiori, ma non inconsistente, di lignina sono osservate all'interno dello strato di parete S2 delle fibre. Variabilità dell'intensità del segnale lignina si trova in una certa misura in CC, CML e S2, soprattutto da fibra a fibra. La risoluzione spaziale laterale nelle nostre misurazioni è ~ 300 nm. La qualità dei dati si presta bene per confrontare tra lignificazionecampioni e per sezionare ulteriormente lignina chimica ^15.

Figura 1: Uno schema della configurazione strumentale BP:. Filtro passa-banda; DM: specchi dicroici, PH: foro stenopeico; LP: longpass filtro.

Figura 2: Uno spettro Raman rappresentante di pioppo (Populus angustifolia) in legno staminali registrato in D ₂ O. L'area evidenziata spettrale (vedi anche il riquadro) segna la regione spettrale con tre picchi specificatamente attribuibile alla lignina.

Figura 3: Raman immagine lignina (in basso) di un pioppo di sezione (in alto: immagine visibile), ottenuta integrando l'intensità del segnale Raman da 1.550 a 1.700 cm ^-1.

Discussion

Materiali lignocellulosici sono gerarchiche ed eterogeneo sia per quanto riguarda struttura e composizione. Per un approfondimento strumenti di caratterizzazione analitica che hanno sensibilità chimica, risoluzione spaziale, e che danno spunti in questi materiali nell'ambito nativi sono desiderabili. Il metodo descritto permette la visualizzazione di lignina e confronto di lignificazione di biomassa lignocellulosica impianto con risoluzione spaziale che è sub-micron, senza macchie o etichettatura dei campioni in un vicino stato nativo. Si richiede una minima preparazione del campione e le misure sono non distruttive e relativamente poco costoso. Il metodo può essere utile nel valutare lignificazione associato con un gran numero di popolazioni nidificanti. Oltre alla lignina, gli spettri Raman contengono anche le impronte digitali spettrale di cellulosa e le emicellulose, che possono essere inclusi in un'analisi globale.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
microscope slides
cover slips
D2O
nail polish
immersion oil
tweezers
pointed brush
microtome
confocal Raman microscope